免疫グロブリンGを検出するための紙ベースのイムノアッセイ

アミン官能化濾紙ディスクから始めて、架橋試薬であるグルタルアルデヒドに浸します。

グルタルアルデヒドは、アミン-アルデヒド反応を介してアミン基と反応します。

ディスクをチューブに入れます。水を加え、振って吸引し、残留グルタルアルデヒドを除去します。

乾燥後、免疫グロブリン-G-Fcフラグメント特異的捕捉抗体を導入します。これらの抗体上のアミン基は、紙ディスク上のアルデヒド基と相互作用し、共有結合固定

化を促進します。

洗浄して結合していない抗体を除去し、ブロッキングバッファーを導入して非特異的結合を防ぎます。

次に、免疫グロブリンG分子を含む試験サンプルを紙ディスクに加えます。免疫グロブリンG分子は捕捉抗体と相互作用します。

事前に結合した免疫グロブリンGと相互作用する西洋わさびペルオキシダーゼ結合IgG-Fcフラグメント特異的検出抗体と重ね

合わせます。

洗浄して結合していない抗体を除去し、発色基質と過酸化水素の混合物を加えます。

過酸化水素の存在下では、西洋わさびペルオキシダーゼは発色基質の酸化を触媒し、椎間板に青色を生成し、免疫グロブリンGの存在を示します。

5ミリリットルの0.05%グルタルアルデヒド溶液を20ミリリットルのガラス瓶に加えます。この溶液に15枚のアミン官能化中流量ろ紙ディスクを浸し、室温で振とうしながら1時間保持します。同時に、このステップを繰り返して、さらに15枚のアルデヒド官能化高速流動濾紙ディスクを調製します。

紙ディスクから未反応のグルタルアルデヒドを除去するには、まず、中流量濾紙ディスクと高速流量濾紙ディスクを別々の 15 ミリリットル遠心分離管に入れます。次に、各チューブに5ミリリットルの脱イオン水を加え、チューブを10秒間振とう。ピペットで吸引して水を取り除きます。2回繰り返して、未反応のグルタルアルデヒドを除去します。

次に、紙ディスクを摂氏37度のオーブンで乾燥させます。乾燥したら、5マイクロリットルの0.025ミリグラム/ミリリットルマウスIgG-Fcフラグメント抗体を中流量ろ紙ディスクに加え、8マイクロリットルを高速流量ろ紙ディスクに加えます。

20分間インキュベートした後、抗体を除去せずに、10マイクロリットルの50ミリモルPBS pH 7.4を各紙ディスクに加えます。アミン-アルデヒド反応のために40分間インキュベートします。ペーパータオルの上に0.2ミリリットルの洗浄バッファーでペーパーディスクを洗います。洗浄を3回繰り返します。

紙ディスクを摂氏37度のオーブンで乾燥させた後、15マイクロリットルのブロッキングバッファーで紙ディスクを室温で10分間ブロックします。次に、ペーパータオルの上に0.2ミリリットルの洗浄バッファーで各紙ディスクを洗浄します。洗浄を3回繰り返します。

次に、IgG標準を実行します。さま