Candida tropicalis Biofilmに対する抗体の影響を評価するためのIn vitroアッセイ

真菌カンジダトロピカリスを含むマイクロプレートを取ります。

細胞は、Msb2と呼ばれる膜貫通糖タンパク質を切断し、その阻害ドメインを除去するタンパク質分解酵素であるSap2を分泌します。

これにより、真菌が底に付着し、酵母と糸状の形のマイクロコロニーに成長します。細胞は可溶性成分と生体高分子を分泌し、バイオフィルムの形成を開始します。

Sap2特異的抗体を含む血清サンプルを選択したウェルに加え、暗所でインキュベートします。

抗体は Sap2 に結合してその活性を中和し、細胞の生存率とバイオフィルムの成熟を妨げます。

未

処理のウェルでは、バイオフィルムは細胞と細胞外マトリックスの密なネットワークに成熟します。

液体を吸引し、バイオフィルムを洗浄し、プレートを自然乾燥させます。発色基質を加え、暗所でインキュベートします。

膜結合酸化還元酵素を利用して生細胞を基質を着色生成物に還元します。

着色された上清を移し、吸光度を読み取ります。

血清処理ウェルの吸光度が低い場合は、抗体を介したバイオフィルム阻害を示しています。

滅菌RPMI1640 MOPS培地で熱不活化血清サンプルの連続希釈液を調製します。選択した血清希釈液を100マイクロリットルを96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えます。

10番目の列に、真菌のみのポジティブコントロールのRPMI1640-MOPS培地のみを追加します。11列目のすべてのウェルに1〜50希釈液の血清を加えて、無真菌プラス血清ネガティブコントロールとして機能します。プレートに蓋とアルミホイルをかぶせた後、プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。

翌日、マルチチャンネルピペットを使用して血清を注意深く吸引した後、逆さまのプレートを軽くたたいて残留血清を取り除きます。PBS洗浄を3回繰り返し、プレートを生物学的安全キャビネット内で室温で30分間自然乾燥させて、余分なPBSを乾燥させます。

次に、25ミリグラムのXTTを50ミリリットルのフィルター滅菌乳酸リンゲル液に溶解します。別々のチューブに10ミリリットルをアリコートします。アルミホイルで覆い、マイナス80°Cで保管してください。次に、8.6ミリグラムのメナジオンを5ミリリットルのアセトンに溶解し、50マイクロリットルを100本の別々のマイクロチューブに分配した後、アリコートを摂氏マイナス80度で保存します。

10ミリリットルのXTTを取り、1マイクロリットルのメナジオンを加えて、1マイクロモルの作業溶液を取得します。96ウェルマイクロタイタープレートのウェルあたり100マイクロリットルのXTTメナジオン溶液を追加します。次に、プレートに蓋とアルミホイルをかぶせた後、暗所で37°Cで2時間インキュベートします。最後に、各ウェルから80マイクロリットルの着色上清を新