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ルマリン固定、ゼラチン充填マウス空腸凍結切片を含む培養皿から始めて、頂端微絨毛とスプール状の体細胞を持つ房細胞を特徴とします。
細胞膜を透過性化するために、界面活性剤を含む緩衝液で洗浄します。
アルカリ性抗原回収液を追加します。インキュベートして固定誘導タンパク質架橋を切断し、染色用のタンパク質を明らかにします。
非特異的抗体結合を防ぐためにブロッキング溶液を塗布します。
タフト細胞で特異的にリン酸化されたアクチン結合タンパク質を標的とする一次抗体と重ね合わせます。
結合していない抗体を除去します。蛍光色素結合二次抗体、DNA結合色素、およびファロイジン蛍光色素複合体の混合物を導入します。
二次抗体は一次抗体に結合し、ファロイジン蛍光色素複合体はアクチンを標識し、DNA結合色素は細胞核をマークします。
結合していない成分を取り除き、界面活性剤を含まない緩衝液を追加します。
切片を接着剤でコーティングされたスライドガラスに移し、メディアで取り付けます。
共焦点顕微鏡下では、管腔先端で蛍光が強くなり、赤い小根の塊が拡張された緑色のスプール状の細胞は、房細胞の存在を示しています。
空腸の切片を準備するには、まずクライオスタットチャンバーの温度と物体の温度の両方を摂氏マイナス22度に設定します。凍結組織ブロックをクライオスタットチャンバー内のクライオモールドに少なくとも15分間置きます。15分後、カミソリの刃でブロックを半分に切り、空腸の横断面を露出させます。ブロックの半分をクライオスタットアダプターに取り付けます。ゼラチンで満たされた空腸を厚さ30ミクロンの切片に切断します。凍結圧子を使用して、切片を35ミリリットルのPBSを含む3ミリメートルの培養皿にそっと移します。
切片を3ミリリットルのPBS-Tでそれぞれ5分間3回洗浄した後、3ミリリットルの新たに調製した抗原回収溶液を、フリーフローティング切片を含む皿に加えます。次に、蓋を閉め、皿と蓋の間の隙間をビニールテープで密閉し、ハイブリダイゼーションインキュベーターで摂氏50度で振らずに3時間インキュベートします。
免疫染色後、PBS中の染色切片の皿を実体顕微鏡に移します。200マイクロリットルのPBSを、AMSコーティングされた白いスライドガラスの中央の液滴に入れます。次に、P200ピペットチップを使用して、1つの空腸切片を皿から液滴に移します。
セクションの位置合わせを調整した後、セクションの周囲に残っているすべてのPBSを吸引します。20マイクロリットルの水性封入剤を加え、培地の上にカバーガラスを置きます。すぐにカバーガラスの端をキシレンベースの封入剤で密封し、共焦点顕微鏡検査を開始する前に2〜3時間乾燥させます。