タンパク質の細胞内局在を可視化する免疫標識技術

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まず、組織構造を安定させるカコジル酸ナトリウム緩衝液で固定心臓切片を洗浄します。切片を四酸化オスミウムに浸して膜脂質を染色します。

染色

に最適なpHを維持するために酢酸ナトリウムで処理します。

染色

生体分子に酢酸ウラニルを添加すると、顕微鏡検査中のコントラストが向上します。

タノールの濃度を上げて組織を脱水し、続いてアセトンを脱水します。

組織を樹脂に埋め込み、極薄切片を取得し、顕微鏡グリッドに転写します。

メタヨウ素酸ナトリウムを導入して四酸化オスミウムを除去し、細胞タンパク質のマスクを剥がします。

この化合物はまた、糖タンパク質を酸化し、グリシン処理によって中和される反応性アルデヒド基を生成します。

ブロッキングバッファーを導入し、非特異的抗体結合を防ぎます。

標的タンパク質に特異的な一次抗体を追加し、続いてビオチン化二次抗体を追加します。

ビオチンに結合するストレプトアビジン共役量子ドットを追加します。

電子顕微鏡下では、量子ドット標識領域はより高いコントラストを示し、標的タンパク質の正確な細胞内局在化を助けます。

24時間の固定後、組織を0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で20分間2回洗浄します。カコジル酸ナトリウム緩衝液から組織を取り出し、室温で2%四酸化オスミウム溶液に4時間

浸漬します。

浸透後、組織を室温で10分間2%酢酸ナトリウム溶液に浸漬します。次に、組織を2%酢酸ウラニル溶液に室温で1時間浸漬します。酢酸ウラニル染色後、段階的なアルコールとアセトンを通して組織を順次脱水します。

稿に記載されているように、脱水組織を低粘度のエポキシ樹脂に埋め込みます。組織を8mmのマイクロモールド、モールドの新鮮な樹脂に入れ、埋め込まれた組織を摂氏70度で一晩硬化させます。ウルトラ45度ナイフで対象領域を見つけたら、淡い金色の極薄切片を製作します。これらの極薄のセクションを、200メッシュの銅グリッドの鈍い側に配置します。

20マイクロリットルのエッチング溶液メタヨルゲン酸ナトリウムをきれいなパラフィンフィルムの上に置いて、抗原のマスキングを解除することから染色を開始します。組織切片を含む乾燥グリッドをエッチング溶液の液滴の上に置きます。セクショングリッドを溶液上に室温で30分間放置します。エッチングした組織切片を蒸留水の液滴の上に60秒間置いて洗浄します。

温で10分間、0.05モルグリシン溶液の液滴に切片グリッドを置くことにより、残留アルデヒドをブロックします。グリッドの端をろ紙で吸い取り、残留グリシン溶液を除去します。セクショングリッドを10〜20マイクロリットルのブロッキング溶液に室温で25分間置きます。

グリッドの端をろ紙で吸い取り、グリッドセクションを抗体希釈液の上に置き、室温で10分間コンディショニングします。グリッド切片を一次抗体とともに加湿チャンバー内で1時間30分間インキュベートします。グリッドをブロット乾燥させ、グリッド切片を抗体希釈剤で2回、それぞれ5分間洗浄します。

グリッド切片をビオチン化二次抗体とともに加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。グリッドをブロット乾燥させたら、グリッド切片を抗体希釈液で2回、それぞれ5分間洗浄します。グリッド切片を市販のストレプトアビジン結合QDで室温の加湿チャンバーで1時間インキュベートします。チャンバーをアルミホイルで覆い、光への曝露を防ぎます。網の端をろ紙で吸い取り乾かした後、網の端を水滴の上に2分間置いて洗浄し、網の端を吸い取り干します。

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Last updated: 18 July 2026