JoVE 実験百科事典
免疫学
0 回視聴 • 3:43 分 • July 8th, 2025
固定マウスの腎臓を取ります。組織内の脂質は光散乱を引き起こし、色素は光の吸収を引き起こし、細胞を不透明にします。
脱脂と脱色のために組織をCUBIC-Lで処理します。CUBIC-Lに含まれるアミノアルコールは脂質や色素を除去し、光散乱を最小限に抑え、透明性を高めます。
CUBIC-Lの界面活性剤分子も細胞を透過化します。
交感神経のニューロンの細胞質チロシンヒドロキシラーゼと血管平滑筋細胞のα-平滑筋アクチンに結合する一次抗体カクテルを導入します。
一次抗体に結合する蛍光色素標識二次抗体を追加します。
抗体処理を維持するために組織の後固定を行います。
水に代わり、タンパク質の屈折率に一致するCUBIC-R+に組織を浸漬することで、光散乱をさらに最小限に抑え、透明性を高めます。
ライトシート蛍光顕微鏡下では、ライトシートが組織を照らし、蛍光色素を興奮させます。
蛍光色素から放出された光をキャプチャし、腎臓の動脈周囲の交感神経分布を示す3次元画像を再構築します。
まず、灌流固定と腎臓サンプリングの直後に、腎臓を摂氏4度の4%パラホルムアルデヒドに16時間浸漬することにより、浸漬固定を行います。PBSを使用して、それぞれ2時間、3回洗浄します。室温で穏やかに振とうしながら、固定腎臓を14ミリリットルの丸底チューブ内の7ミリリットルの50%CUBIC-Lに浸漬することにより、脱色および脱脂プロセスを実行します。
6時間後、腎臓を14ミリメートルの丸底チューブに7ミリリットルのCUBIC-Lに浸し、摂氏37度で穏やかに振とうしながら5日間浸します。CUBIC-Lを毎日リフレッシュしてください。脱色と脱脂が完了したら、サンプルの取り扱いに分注スプーンを使用し、室温で PBS で腎臓を 2 時間 3 回洗浄します。
染色緩衝液で希釈した一次抗体の脱脂腎臓を、摂氏37度のインキュベーターシェーカーで7日間穏やかに振とうしながら免疫染色します。次に、PBSTとしても知られるPBS中の0.5%Triton X-100で腎臓を室温で1日洗浄します。二次抗体染色の場合は、暗所で染色バッファー内の二次抗体で腎臓を37°Cで7日間穏やかに振とうして処理します。室温で1日PBST洗浄で染色を固定します。
固定後、腎臓をPBの1%ホルムアルデヒドに3時間浸漬し、室温でPBSで6時間洗浄します。腎臓を14ミリリットルの丸底チューブに7ミリリットルの50%CUBIC-R+に1日浸漬し、1日振とうして実行し、続いて7ミリリットルのCUBIC-R+で室温で2日間振とうして治療します。