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キンソン病患者の皮膚生検を包埋培地に包んだ凍結切開を行います。
組織は、最も外側の表皮、下にある真皮、および神経によって神経支配される皮下脂肪で構成されています。
セクションを洗浄して包埋培地を除去します。それを透過処理遮断液に移し、細胞を透過処理し、非特異的結合部位を遮断します。
切片を一次抗体カクテルに浸漬して、遊離浮遊染色と呼ばれる均一な抗体標識を実現します。
抗体はニューロンに入り、軸索に沿って分布するα-シヌクレイン凝集体(神経変性疾患に特徴的な凝集型)およびカルボキシル末端加水分解酵素に結合します。
一次抗体に結合する蛍光色素結合二次抗体を導入します。
核を染色する蛍光DNA結合色素で処理します。
ティッシュをスライドの上に置き、封入剤を塗布し、カバーガラスで密封します。
共焦点顕微鏡下では、両方の抗体からの蛍光により、真皮ニューロンの軸索に沿ったα-シヌクレイン凝集体の存在が明らかになります。
まず、新鮮な96ウェルプレートのウェルの一部に100マイクロリットルの洗浄液を入れます。分析する切片を保存プレートから洗浄液が入っている切片に移します。切片を洗浄液に室温で10分間放置します。次に、各セクションを同じ洗浄液の入った空のウェルに移し、洗浄を繰り返します。次に、切片に洗浄液を加え、100マイクロリットルのブロッキング溶液を含む新しいウェルに移します。室温で少なくとも90分、最大4時間インキュベートします。
一次抗体、抗PGP9.5および抗5G4を作業溶液中で希釈します。切片を100マイクロリットルの一次抗体の作業溶液を含む新しいウェルに移し、室温で一晩インキュベートします。
翌日、前述のように洗浄液を含むウェルで切片を洗浄します。二次抗体を希釈します - 抗PGP9.5を検出するヤギ抗ウサギと、作業溶液中の5G4を検出するヤギ抗マウス。
洗浄切片を、100マイクロリットルの二次抗体の作業溶液を含む新しいウェルに移します。二次抗体と結合した蛍光色素の漂白を避けるためにプレートをアルミホイルで覆い、室温で90分間インキュベートします。
この後、前述のように洗浄液で切片を2回洗浄します。洗浄した切片を100マイクロリットルのDAPIを含む新しいウェルに室温で5分間移します。前述のように、切片を洗浄液で2回洗浄します。次に、セクションをスライドの正しい位置に取り付け、折りたたまれないようにします。
スライドに数滴の封入剤を加え、カバーガラスでセクションを覆います。スライドを一晩乾燥させます。翌日、スライドを摂氏 4 度の適切な箱に入れ、光にさらさないように
保管します。倒立蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、セクションを表示します。顕微鏡に接続されたカメラで画像を取得します。次に、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、テキストプロトコルで概説されているように、信号の空間分布と強度の観点から、切片内の陽性シグナルを分析します。