プリンテッド糖鎖アレイによる循環型抗糖鎖抗体の検出

ア

レイのブロックに編成された印刷された糖鎖サブアレイを特徴とする機能化グリコチップから始めます。

サブアレイ内の各スポットは、単糖類の組成、鎖長、分岐パターンが異なる炭水化物ベースのポリマーである、異なる糖鎖を表します。

グリコチップをブロッキングバッファーで処理して、非特異的相互作用部位をブロックします。

グリコチップを転移し、希釈したマウス血清を界面活性剤を添加したバッファーに導入して、抗体凝集を最小限に抑えます。攪拌下でインキュベートします。

撹拌は均一な血清分布を促進し、異なる分子特性に基づいて抗糖鎖抗体と特定の糖鎖の選択的結合を促進します。

非特異的結合を妨害するために、界面活性剤含有バッファーの濃度を下げて洗浄し、すすぎます。

グリコチップに抗マウスビオチン結合二次抗体を重ね、事前に結合した抗糖鎖抗体と相互作用して洗浄します。

蛍光色素標識ストレプトアビジンを導入し、ビオチン化二次抗体に結合します。余分な溶液を洗浄して取り除きます。

グリコチップをスキャンし、血清中の糖鎖特異的循環抗体を示唆するさまざまな位置に明確な蛍光スポットがないか観察します。

テキストプロトコルで説明されているように、バッファー#1からバッファー#4までを準備します。グリコチップとサンプルを調製するには、スライドの入った保存ボックスを室温になるまでテーブルの上に置きます。箱を開けてグリコチップをインキュベーションチャンバーに移し、チャンバー内の湿度を一定に保つために湿ったろ紙ですでに調整する必要があります。

そ

の間に、マウス血清を1.5ミリリットルのチューブにバッファー1で希釈します。ボルテックスミキサーで血清溶液を5秒間均質化します。均質化後、希釈した血清を摂氏37度で10分間インキュベートし、免疫グロブリンの凝集を防ぎます。次に、チューブを10,000倍g、摂氏25度で3分間遠心分離します。

上清を回収し、沈殿した物質を廃棄します。グリコチップをインキュベーションチャンバーに慎重に置きます。1ミリリットルのバッファー#3と一緒にインキュベートして、グリコチップの表面に残留物質を除去します。摂氏25度で15分間、グリコチップを垂直位置に保持し、プラスチック製のパスツールピペットを使用してバッファー#3を数滴垂らして再洗浄します。

次に、濾紙を使用してグリコチップ表面から緩衝液を慎重に取り除きます。グリコチップをインキュベーションチャンバーに戻します。マイクロピペットを使用して、希釈した血清サンプルをグリコチップ表面に広げます。ピペットの先端を使用して、グリコチップ表面のすべての乾燥領域が希釈血清サンプルで覆われていることを確認します。

摂氏37度で1時間半のオービタル攪拌でインキュベートします。インキュベーション後、余分なサンプルを取り除き、グリコチップを摂氏25度のバッファー#3に5分間浸漬します。グリコチップをバッファー#4の入った容器に渡し、最後にグリコチップを超純水で洗浄します。

グリコチップを175倍g、摂氏25度で1分間遠心分離して液体を除去します。グリコチップをインキュベーションチャンバーに戻した後、ビオチンに結合したヤギ抗マウスの溶液をグリコチップ表面に広げます。摂氏37度で1時間オービタル撹拌でインキュベートします。結合していない部分を取り除き、洗浄手順を繰り返します。

遠心分離後、グリコチップを摂氏25度の暗闇で45分間、バッファー#2中の対応する蛍光色素標識ストレプトアビジン溶液1ミリリットルあたり2マイクログラムでインキュベートします。暗闇の中で作業して結合していない画分を除去し、洗浄手順を繰り返した後、グリコチップを空気で乾燥させます。

アレイをスキャンするには、暗闇の中で室温に達するまでグリコチップをテーブルの上に置いたままにします。同時に、スライドスキャナーとレーザーの電源を入れます。マイクロアレイを持って、グリコチップが背面に触れるまでスロットにスライドさせます。Easy Scanを実行してグリコチップをスキャンし、スキャンを.tiffファイルとして保存します。