ゼブラフィッシュ放射状グリア前駆細胞におけるNotch/DeltaDシグナル伝達のイメージングのための抗体取り込みアッセイ

ア

ガロースに包埋された脱絨毛膜ゼブラフィッシュ胚を含む培養皿を顕微鏡ステージ上に置きます。

赤色蛍光標識抗体と抗デルタD抗体を含む低濃度の抗体複合体を含む色素溶液を取ります。

胚の後脳室に色素溶液を注入し、活発に分裂する放射状グリア前駆細胞またはRGPを標的とします。

埋め込まれた胚を解放し、栄養豊富な培地で回収します。

回収中に、蛍光複合体はRGP上のいくつかのノッチリガンドデルタD分子と相互作用し、内在化とエンドソーム形成を開始します。

抱合体濃度が低いため、結合していないDeltaDリガンドがNotch受容体と相互作用し、RGPのNotchシグナル伝達経路を活性化します。

回復後、アガロースを含む麻酔した胚を、背側を下にしてガラス皿に移してイメージングします。

タイムラプス蛍光イメージングを実行して細胞分裂をキャプチャし、DeltaDを含む蛍光エンドソームが2つの娘細胞に不斉に分割されていることを示し、Notch / DeltaDシグナル伝達の活性化を確認します。

埋め込まれた胚を実体顕微鏡下に置き、アガロースを卵水で覆います。マイクロマニピュレーターで空気圧インジェクターをセットし、顕微鏡の近くに置きます。空気資源として、高圧下でガス状窒素を含んだスチール製ガスボンベを使用します。

胚がアガロースに取り付けられたら、ガスバルブを開きます。マイクロインジェクターのフロントフィルモジュールを使用しながら、準備したガラス針に2マイクロリットルの抗体混合物をマイクロマニピュレーターにフロントロードします。次に、入力圧力を 80 から 90 ポンド/平方インチに調整し、射出圧力を 20 ポンド/平方インチに調整します。

顕微鏡下でマイクロメーターを使用して注入量を校正します。針の開口部のサイズに応じて、10〜120ミリ秒の調整時間を設定します。ペダルを踏んで各注入パルスを供給し、各注入量を4〜5ナノリットルに調整します。

次に、顕微注射針の先端を後脳の背側屋根板、菱形0/1ヒンジポイントの後方に突き刺し、脳組織に当たらずに約10ナノリットルの抗体混合物を注入します。脳室内の赤い液体の流れを観察します。

注射後、マイクロマニピュレーターのノブを回して、針先を胚から素早く取り除きます。注射を成功させるために、注入された混合物の赤い染料は、周囲のアガロースに漏れることなく、脳室に安定して残ります。取り付けプレートを顕微鏡下で移動して、別の取り付けられた胚をリピートに適した位置に配置します。

6〜8個の胚を注入した後、顕微手術用ナイフでアガロースを剥がし、埋め込まれたアガロースから胚を解放します。マイクロインジェクションされた胚を30ミリリットルの胚培地を入れた新鮮な皿に移し、次のステップのために室温に置きます。30分後、選択した胚を10ミリリットルの胚培地に移します