植物組織におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの免疫局在

さまざまな植物組織の薄い切片を含む反応ウェルでスライドを取ります。組織は固定され、免疫染色のために樹脂内に埋め込まれます。

スライドを暗くて湿気の多いインキュベーションチャンバー内に置き、後続のステップでの光への曝露や試薬の蒸発を防ぎます。

非特異的抗体相互作用を防ぐためにブロッキング溶液を導入します。

洗浄して余分なブロッキング溶液を除去し、抗原特異的一次抗体を加えてインキュベートします。

抗体は、標的抗原、すなわち細胞壁のアラビノガラクタンタンパク質とペクチンに結合します。

一次抗体に結合する蛍光色素結合二次抗体を導入します。

洗浄して結合していない抗体を除去し、セルロースに結合する蛍光色素を塗布して細胞壁を標識します。

封入剤を追加し、カバーガラスで密封します。

顕微鏡下では、色素と結合した抗体からの蛍光は、アラビノガラクタンタンパク質またはペクチンと共局在した植物細胞壁内のセルロースを視覚化するのに役立ち、それらの組織特異的分布を示します。

反応スライド用のインキュベーションチャンバーを準備するには、ピペットチップボックスの底に湿らせたペーパータオルを置き、ボックスをアルミホイルで包みます。スライドをボックスからインキュベーションチャンバーに移します。50マイクロリットルのブロッキング溶液を各ウェルにピペットで入れます。スライドを10分間インキュベートした後、ブロッキング溶液を取り除きます。次に、すべてのウェルをPBSで毎回10分間2回洗浄します。原稿に記載されているように一次抗体溶液を調製した後、蒸留脱イオン水でウェルを5分間最終洗浄します。

一次抗体溶液を反応ウェルにピペットで入れます。次に、ブロッキング溶液をコントロールウェルにピペットで入れます。インキュベーションチャンバーを閉じます。室温で2時間放置した後、摂氏4度で一晩冷蔵します。ブロッキング溶液中に二次抗体の1%溶液を調製します。ウェルあたり約40マイクロリットルが必要になります。

溶液をアルミホイルで覆います。反応スライドのウェルをPBSで2回、蒸留脱イオン水で1回、毎回10分間洗浄します。井戸内にブロッキング溶液や堆積物が残っていないことを確認してください。二次抗体溶液をすべてのウェルにピペットで入れます。スライドを室温で暗所で3〜4時間インキュベートします。

ここでも、反応スライドのウェルをPBSで2回、蒸留脱イオン水で1回洗浄します。次に、カルコフルオアホワイトを各ウェルに一滴加えます。洗浄せずに、各ウェルに封入剤を一滴加え、各ウェルをカバーガラスで覆います。蛍光顕微鏡を使用して反応スライドのサンプルセクションを観察します。

観察ごとに、UVフィルターを使用してカルコフルオールで染色された細胞壁を検出し、FITCフィルターを使用して免疫局在を検出します。結果をより適切に視覚化するには、ImageJまたは同様の画像解析プログラムを使用して、各UVフィルター画像を対応するFITCフィルター画像とマージします。