サンドイッチELISAを使用したワクチン中の免疫原性糖タンパク質含有量の測定

犬病、免疫原性糖タンパク質特異的モノクローナル抗体、および非特異的相互作用を防ぐためのブロッキング剤でコーティングされた不動態化アッセイプレートから始めます。

糖タンパク質含有量が減少する連続希釈参照ワクチンと試験狂犬病ワクチンを導入します。汚染を防ぐためにプレートを密封します。

インキュベーション中、免疫原性糖タンパク質は、特定の抗原部位を介してコーティングされたモノクローナル抗体と相互作用します。

インキュベーション後、フィルムを取り除き、上清を吸引し、プレートを洗浄します。

糖タンパク質上の異なる抗原部位に結合し、免疫複合体を形成する酵素結合糖タンパク質特異的モノクローナル抗体と重ね合わせます。

基質と発色原を含む溶液を加えます。基質が酵素と相互作用すると、発色原の酸化を引き起こし、溶液の色が変化します。

酵素を不活性化するために停止液を追加します。

吸光度を測定し、参照ワクチン値を使用して参照曲線を生成します。

吸光度と参照ワクチン希釈液の糖タンパク質含有量との間に線形関係がある領域を特定します。次に、この領域内に収まる吸光度に基づいて、試験ワクチン希釈液の糖タンパク質含有量を推定します。

ブレードを洗浄するには、各ウェルに300マイクロリットルの洗浄バッファーを追加します。次に、慎重に吸引し、ウェル内容物を2.6%次亜塩素酸ナトリウムの溶液を含むレシピエントに移します。この洗浄プロセスをさらに5回繰り返して、増感プレートを広範囲に洗浄します。

この後、マイクロプレートを反転させ、吸収紙の上で室温で1分間乾燥させます。狂犬病ウイルス糖タンパク質の最終濃度が1ミリリットルあたり10マイクログラムになるように、参照ワクチンを1ミリリットルの蒸留水中に再構成します。希釈液で再構成した参照ワクチンを10倍に希釈して調製し、狂犬病ウイルス糖タンパク質濃度を1ミリリットルあたり1マイクログラムにします。

次に、テキストプロトコルの表1に概説されているように、希釈液中でこの参照ワクチンを6回連続2倍希釈します。200マイクロリットルの希釈液を200マイクロリットルの希釈液を2つのウェルに分配してブランクコントロールとして使用し、各参照ワクチン希釈液にウェルあたり200マイクロリットルを200マイクロリットルを2回分配します。

次に、希釈液中で試験ワクチンの10倍希釈液を調製し、テキストプロトコルの表2に概説されているように、希釈液中で試験ワクチンの7つの2倍連続希釈液を調製します。テストされた各ワクチン希釈液200マイクロリットルをマイクロプレートの各ウェルに2回ずつ分配します。マイクロプレートを粘着フィルムで覆い、摂氏37度で1時間インキュベートします。

この後、フィルムを取り除き、慎重に吸引し、各ウェルの内容物を2.7%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに移します。プレートを洗浄するには、各ウェルに300マイクロリットルの洗浄バッファーを追加します。慎重に吸引し、各ウェルの内容物を2.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに移します。

洗浄プロセスをさらに5回繰り返して、結合していない抗原を除去します。そして、コーティングされた抗体に結合したGタンパク質三量体を保存します。洗浄したマイクロプレートを反転させ、吸収紙の上で室温で1分間乾燥させます。次に、ペルオキシダーゼ標識D1モノクローナル抗体の推奨希釈液200マイクロリットルを希釈液で各ウェルに分配します。

マイクロプレートを粘着フィルムで覆い、摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、フィルムを取り除き、慎重に吸引し、各ウェルの内容物を2.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに移します。マイクロプレートを洗浄するには、各ウェルに300マイクロリットルの洗浄バッファーを追加します。

慎重に吸引し、各ウェルの内容物を2.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに移します。この洗浄プロセスをさらに5回繰り返して、結合していないペルオキシダーゼ標識抗体を除去します。洗浄マイクロプレートを反転させ、吸収紙の上で室温で1分間乾燥させます。

次に、200マイクロリットルの基質発色原溶液を各ウェルに分配します。マイクロプレートをフィルムで密封し、室温で暗所で30分間インキュベートします。次に、各ウェルに50マイクロリットルの停止液を加えて反応を停止します。

マイクロブレードの底を慎重に拭き、分光光度計に入れます。使用するすべてのウェルの492ナノメートルでの光学密度を決定します。このデータをスプレッドシートファイルに収集して分析します。この後、テキストプロトコルで概説されているように、参照ワクチン曲線と光学濃度値の両方のプロットを作成します。