Name: 器官型コラーゲンIアッセイ：3次元コンテキストでのセルの挙動を評価するための可鍛性プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶ 3次元コラーゲンIマトリックスを用いた器官型アッセイ法。ラット尾腱由来コラーゲンと線維芽細胞で組織様環境を構築し、腫瘍細胞の浸潤・転移を可視化する技術です。蛍光顕微鏡と免疫組織化学染色で細胞挙動を解析できます。

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1。皮膚外植片からの線維芽細胞培養の確立<ol><li> 100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、及び0.25μg/ mlのファンギゾンを補った人間の前腕から取得した4ミリメートルパンチ生検をMEMに配置されます。 </li><li>任意の皮下脂肪をトリミングして、細かくシャーレの底面に24番メス刃を揺動することにより、小さな断片に生検を切り刻む。 </li><li>フラスコの表面になるまで一次性線維芽細胞増殖培地（MEM、10％FCS、100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、及び25μg/ mlのファンギゾンを補充）を25cm 2の組織培養フラスコに入れ、組織のスラリーは、追加された覆われたが、液体の深さは、組織が浮遊するのは不十分である。 </li><li> 5％CO 2の加湿雰囲気中で37℃で3日間インキュベート℃に続いて、プライマリー繊維芽細胞増殖培地3mlを加える。 </li><li>新鮮なプライマリー繊維芽細胞増殖培地を使用して別の3日間のインキュベーション変化媒体の後、またはCEL場合lsはほぼコンフルエントになる彼らは、新鮮な培地に1:4に分割されることがあります。 （ファンギゾンはこれ以降省略できます）。 </li></ol> 2。ステージI - ラットの尾からコラーゲンIの調製注：約12から14思春期（生鮮または冷凍）ラットの尾のためのプロトコル<ol><li> 70％エタノールで洗浄することにより、ラットの尾を用意し、次のように腱を削除します。 </li><li>尾の長さに沿ってメスをむきで上から下へ尾の真ん中にスライスして、ラットの尾部から皮膚を取り除きます。 </li><li>尾の近位領域のコアから腱をデタッチします。 </li><li>歯鉗子を用いてシースを避け尾の先端領域に向かって腱を削除します。 </li><li> 48時間4℃で撹拌することにより腱の1グラム/ 0.5 M酢酸250mlを抽出します。 </li><li> 30分間抽出物（7,500×gで）を遠心し、ペレットを捨てる。 </li><li>上清にNaClを10％（w / v）の等量を追加し、30〜60分間かき混ぜる。 </li><l30 m><li> 6Lの6-8変化〜17.5 mM酢酸（冷たい水のリットル当たり1ミリリットル氷酢酸、変化2×毎日）に対してコラーゲン溶液を透析する。 </li><li> 1.5時間、30,000 xgで透析コラーゲンを遠心分離します。 </li><li>無菌フラスコ内の上澄みと場所を削除します。 </li><li> 〜2 mg / mlの濃度に私は4で0.5mMの酢酸を用い℃のコラーゲンを調整</li></l30></ol> 3。ステージII - 埋め込まれた繊維芽細胞（8日間の契約を許可する）と3Dマトリックスを設定します。 <ol><li> 4時に冷たい試薬を使用してミックスを組み立てる°予冷ボトルのC。氷の上でコラーゲンIを保管してください。 </li><li>コンフルエントプライマリー繊維芽細胞の1 T75フラスコ（〜細胞数1×10 6）のために使用： <ul><li> 25mlのラット尾部コラーゲン（約2mg/mLの濃） </li><li> 10xの3ミリリットルMEM </li><li> 0.22 M NaOHを：まず最初に、コラーゲンがオレンジ色に点​​灯するまで、攪拌2ミリリットル、次に滴下しながら追加し、 </li><li>はなく、ピンク（通常最大3ミリリットル）。おおよそのP H = 7.2。 </li><li>注：これは、少しでもアルカリ性条件にさらされると線維芽細胞がゲルにかからないように培地/ゲルは中性またはわずかに酸性のままであることを確認することが重要です。 </li></ul></li><li> 、線維芽細胞をTrypsinise ​​5分間400 xgでスピンし、上清を除去します。 </li><li> 5分の間に、上記スピン：12×35ミリメートルプラスチック皿を準備する - 通常は線維芽細胞/コラーゲンミックスの1つのフラスコから12皿を達成。 </li><li> 3ミリリットルFCSで線維芽細胞を再懸濁するとすぐにコラーゲンミックスに追加し、かき混ぜる。 </li><li>プレートの約2.5ミリリットル皿当たりコラーゲン/線維芽細胞、できるだけ早く。気泡やコラーゲンの設定を避けるようにしてください。 </li><li>コラーゲンは10分間空気中5％CO 2の加湿雰囲気中で37℃で設定してみましょう。 </li><li>成長する線維芽細胞の1ミリリットルを追加目の培地（DMEM +10％FCS）。 </li><li>ピペットを用いて皿の両側からコラーゲン/線維芽細胞マトリックスをデタッチします。 </li><li>次の日：繊維芽細胞増殖培地（DMEM +10％FCS）の1ミリリットルを追加します。 </li><li>一日おきにメディアを変更してください。彼らは、24ウェルディッシュに収まるまで、約8日間の契約にコラーゲン/線維芽細胞マトリックスを許可する（直径1.5cmに〜3.5 cmから収縮、図1を参照）。 </li></ol>注：コラーゲン濃度は、アプリケーションに合わせて調整する必要があります。より多くのコラーゲン溶液を希釈し、速く、それは線維芽細胞によって収縮されます。収縮率のわずかな違いは、同じ濃度でコラーゲンの異なるバッチで経験されます。同様に、種々の線維芽細胞培養は、収縮速度より速い、異なるレートであり、本より線維芽細胞のコラーゲンゲル収縮する。コラーゲン濃度および線維芽細胞密度が故にによって収縮率を変更するために調整することができ、コラーゲンゲルの、最終的な密度。 4。ステージII - マトリックスの上に興味のあるメッキ細胞注意：使用前にエタノールですべての鉗子や機器を滅菌する。 <ol><li>鈍鉗子を使用して、静かに24ウェルディッシュに委託行列を移動します。それが倍にしないことを確認してください。 </li><li>マトリックスの上に約4×10 4個 / mlとプレート1ミリリットル（トリプシンを取り除くためtrypsinising、スピン細胞の後）に興味のある細胞の懸濁液を準備します。必要なセルの実際の数は、使用する細胞の種類によって異なります。細胞培地は、目的の細胞の正常な増殖培地である必要があります。 </li><li>細胞は約3〜5日、マトリックスの上に合流に成長することができます。 </li></ol> 5。ステージIII - 侵略のためのグリッド（約0から21日）に行列を転送<ol><li>三脚を作成します（図2を参照してください）​​使用前にオートクレーブにステンレス鋼の格子を切った。 </li><li>に滅菌グリッドを配置6cmディッシュには、グリッド上のレベル（約10.5ミリリットル）に増殖培地を追加します。場所は、グリッド上の行列と行列の底がメディアに接触しているが、水没しないように静かに培地を吸引。これは、侵略を推進してグラデーションを作成し、空気/液体界面、と呼ばれています。 （図2を参照）は2日ごとに培地を交換してください。 </li><li>細胞を生き、蛍光細胞を用いた文脈イメージングは​​、この段階またはそれ以前のバージョンで画像化することができる。委託または線維性コラーゲンは、私は第二高調波発生（SHG、図3を参照）を使用して画像化することができる。我々は細胞質GFPを発現する細胞は、少なくとも200μmの深い撮像することができる一方、SHGは、マトリックス内に少なくとも100μmを撮像することができることがわかり、広い視野検出と組み合わせた多光子励起を用いた。 </li></ol>注：浸潤の定量化に関して、matriciesがグリッド上に配置された日を0日を定義します。グリッド上の配置は、侵略のintを促進する細胞培養培地のグラデーションを生成行列をO。 （参考文献一覧表を参照）などの侵入、増殖、生存や分化などの生物学的プロセスを評価するために、21日（またはそれ以上） - サンプルは、次の1の上に結像させることができる。 6。ステージIV - ギャグ<ol><li>ファルコンチューブに4％PFAの5ミリリットルを追加します。 </li><li>平らな表面に行列を転送します。新鮮なきれいなメス（あなたは断面を染色されるように）と半分に行列を切り取り、一晩固定し、メス、4％PFAへの転送で行列を持ち上げる。 </li><li>器官の行列になりました（図3参照）選択抗体/染色で染色する準備が整いました。 </li></ol> 7。代表の結果： <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図線維芽細胞とシャーレから切り離されて6-8日以上の契約を許可ラット尾部コラーゲンの線維芽細胞の契約コラーゲンIの混合物の1例 。 図2は "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/&gt; 2器官アッセイの進行を示しています。セットアップ、器官の概略と進行B、ステンレス鋼の上にコラーゲン/線維芽細胞マトリックスの例は、空気/液体界面を作成するための無菌グリッド。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 器官型アッセイの3アプリケーションを示しています。 A、B、非侵襲的および侵襲性膵管腺癌（PDAC）細胞が器官行列で時間をかけて侵入C、線維芽細胞、契約コラーゲン真皮成分で層状表皮を示す皮膚等価物を生きD、線維芽細胞に侵入C8161メラノーマ細胞はコラーゲン真皮同等E、器官マトリックス内に相互作用し、線維芽細胞（赤）と侵略侵襲PDAC細胞（緑）縮小した。Fは

<ol><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+regulation+of+fibroblast+hyaluronan+expression%3A+a+mechanism+to+facilitate+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion.</a> Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).</li>
<li>Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+breast+cancer+cells+in+vivo+requires+both+paracrine+and+autocrine+loops+involving+the+colony-stimulating+factor-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor.</a> Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).</li>
<li>Serrels, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+study+of+E-cadherin+and+membrane+dynamics+in+living+animals%3A+implications+for+disease+modeling+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development.</a> Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
<li>Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Methylumbelliferone+inhibits+tumour+cell+growth+and+the+activation+of+stromal+hyaluronan+synthesis+by+melanoma+cell-derived+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors.</a> Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+characteristics+of+transformed+keratinocytes+from+mouse+and+human+skin+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).</li>
<li>Nystrom, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205, 468-475 (2005).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+regulation+of+TGF-beta+and+connective+tissue+growth+factor+expression%3A+a+role+in+suppression+of+scar+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation.</a> Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

ここでは、侵襲的な細胞遊走6-8の研究に適した3次元マトリックスの産生するための方法を提示する。行列は初代ヒト表皮繊維芽細胞によって数日間にわたって契約しているコラーゲンタイプ1線維で構成されています。コラーゲンは、ポリペプチドの両端に反応性を保持し、バッファー条件9を中和する際に大きな凝集体にコラーゲン線維の架橋を促進する酸抽出ではなく、酵素消化することにより調製される。より密接に、生体内でのコラーゲンの機能を模倣し、ゲル中で培養した細胞の浸潤特性にとって重要な意味を持って再構成し、ゲル中のこの結果。コラーゲンの架橋は、若い動物ではより不安定であるので、それが新鮮または凍結出発物質が使用されているかどうかは重要ですが、思春期のラットの尾を使用しないことが重要です。若い動物からコラーゲンIはw従って抽出することが容易であり、再構成i番目に高い忠実度。 コラーゲンマトリックスを固定し、染色し浸潤性腫瘍細胞又は間質線維芽細胞2,10のいずれかに対して向けられた抗体を用いて5,6および浸潤を抑制する可能性がある薬剤の有効性をテストするために非常に有用であることができます。 このプロトコルは、初代ヒト皮膚線維芽細胞の使用を示唆しているが、それは調査対象組織の種類に応じて、他の組織型からプライマリー繊維芽細胞を使用することが可能である。それが安定して蛍光タンパク質複合体でトランスフェクトされた細胞を含む不死化線維芽細胞を用いて、文化を確立することも可能です。このように両方のストローマ細胞と腫瘍細胞が浸潤11時の細胞間相互作用を可視化するためにラベルを付けることができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名称</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（オプション） </th></tr><tr><td> 10xのMEM </td><td>ギブコ</td><td> 21430 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaOHを</td><td>シグマ</td><td> 367176-500G </td><td>水に0.22 Mのストックを準備</td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAAラボラトリーズ</td><td> A15-101 </td><td> - </td></tr><tr><td> 35ミリメートル皿</td><td>ファルコン</td><td> 353001 </td><td>ステップ3.4の</td></tr><tr><td> 60ミリメートル皿</td><td>ファルコン</td><td> 353004 </td><td>ステップ5.2の</td></tr><tr><td>春鉗子鈍</td><td>サムコ</td><td> E003/02 </td><td>スムーズではありません、歯</td></tr><tr><td> 16％パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡のサービス</td><td> 15710 </td><td>使用前にPBS中の4％に希釈</td></tr><tr><td> CD-1、サイズ40メッシュのスクリーン</td><td>シグマ</td><td> S07707-5EA </td><td>ステンレススチールグリッド、パックごとに5 </td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td> Medicell国際</td><td> 7607 2295 </td><td> 12から14 kDの</td></tr><tr><td> PBS </td><td>オキソイド</td><td> BR0014G </td><td> - </td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマ</td><td> 242853 </td><td> - </td></tr><tr><td> 24ウェルディッシュ</td><td>ファルコン</td><td> 353047 </td><td>ステップ4.1の</td></tr><tr><td>ファンギゾン</td><td> vitrogenで</td><td> 15290018 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

器官型コラーゲンiアッセイ：3次元コンテキストでのセルの挙動を評価するための可鍛性プラットフォーム

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

細胞遊走は、開発、創傷治癒、免疫系の細胞応答、腫瘍細胞の転移を含む生物学の多くの側面に基本的である。移行は、光学顕微鏡で調査に従順セルラーダイナミクスを作るためにガラスカバースリップ上に研究されてきた。しかし、これは細胞遊走の多くの側面を忠実にガラスやプラスチックなどの硬質1二次元の基板では表現されないため、その弾力性、タンパク質組成物、および細孔径など、ローカル環境の機能に依存することが明らかになってきた。さらに、間質線維芽細胞2、免疫細胞3を含む他の細胞型との相互作用は、癌細胞の浸潤を促進する上で重要な役割を果たすことが示されている。分子レベルでの調査がますます比較した場合、同一の細胞の薬物治療への反応を含む分子動力学は、大きく異なっていることが示されている<em&gt; in vitro および in vivoの4インチ 理想的には、生体内でその天然に存在する文脈における細胞遊走を勉強するのがベストですが、これは常に可能とは限りません。そのような細胞由来マトリックス、マトリゲル、器官培養（ここで説明）組織外植片、オルガノイド、および異種移植片のような中間組織培養システムは、それゆえに重要な実験的な中間体である。これらのシステムは生体内環境でのおおよその特定の側面を、そのような安定的にトランスフェクトされた細胞株、薬物治療計画、長期的かつ高分解能イメージングの使用などの実験操作に対してより適している。このような中間システムは 、in vivo で 5イメージングを引き受ける前にプローブを検証し、イメージに細胞や蛍光レポーターの動的応答に必要なパラメータを確立するための根拠を証明として特に有用である。このように、彼らは、リヴィンの実験の必要性を低減する上で重要な役割を果たすことができるG動物。

メソッドは、I型コラーゲンと初代ヒト線維芽細胞からなる3次元マトリックスの調製について記載されています。この器官ゲルは、それが組織の間質の基本的な機能を模倣し、顕微鏡の多くの形態が可能であるため、侵襲的な細胞遊走を評価するために有用な基質として機能します。

器官型コラーゲンIアッセイ：3次元コンテキストでのセルの挙動を評価するための可鍛性プラットフォーム

細胞移動は、発生、創傷治癒、免疫系の細胞応答など、生物学の多くの側面に不可欠であり、...

この手順の全体的な目的は、細胞機能を研究するために、組織に似た三次元コラーゲンマトリックスを構築することです。まず、ラットの尾腱からコラーゲンを抽出します。次に、線維芽細胞の存在下でコラーゲン線維を再構成し、線維芽細胞にコラーゲンゲルを収縮させます。第3段階として、最終ステップで腫瘍細胞をマトリックスの上に配置します。マトリックスをメタルグリッドの上でインキュベートして気液界面を形成し、腫瘍細胞のマトリックスへの浸潤を可能にします。最終的に、免疫組織化学染色および蛍光顕微鏡観察を行うことで、腫瘍細胞の浸潤や異なる細胞種間の相互作用を含む、マトリックス合成および細胞遊走の解析が可能です。したがって、この手法は浸潤や転移、および腫瘍の発生を観察するのに最適です。複雑な三次元構造において、分化、細胞生存、細胞増殖などを検討することが可能です。特に、浸潤という重要なイベントの間に腫瘍細胞がストロマ（間質）とどのように相互作用するかを詳細に観察することができます。癌転移の初期段階の一つである、皮膚インプラントからの線維芽細胞培養を確立します。まず、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびファンギゾーンを添加したMEMをペトリ皿の底に数滴滴下します。次に、ヒト前腕から採取した4 mmのパンチ生検組織を皿に入れます。次に、最後に、24番のメス刃をペトリ皿の底に当てて揺らしながら、生検組織を細かく刻みます。組織のスラリーを25 cm²の組織培養フラスコに入れます。その後、組織の上に初代線維芽細胞増殖培地を注ぎます。これでフラスコの底面を覆うには十分ですが、組織を浮遊させるには不十分です。フラスコを5%CO2の加湿条件下、37 °Cで3日間インキュベートし、さらに3日間経過後、一次線維芽細胞増殖培地を3 mL添加します。インキュベーション後、培地を新鮮な一次線維芽細胞増殖培地に交換してください。細胞がほぼコンフルエントになった場合は、新鮮な培地を用いて新しいフラスコに1対4の比率で継代します。まず、ラットの尾を70% Ethanolで洗浄します。ラットの尾から腱を除去するため、0.5 molar 酢酸のボトルを4 °Cで冷却しておきます。最初に、個々のラットの尾から皮膚を取り除きます。次に、尾の近位領域の芯から腱を剥離します。最後に、ピンセットを用いて尾の遠位領域に向かって腱を除去します。腱の除去後、ガラス製三角フラスコに0.5 molar 酢酸を250 milliliters加えます。腱を抽出した後、酸250 millilitersにつき腱1 gramを加え、4 °Cで48時間攪拌して抽出します。酸と腱の混合液を4 °Cで7,500 ×gにて30分間遠心分離し、ペレットを廃棄します。次に、上清に同量の10% w/v NaClを加え、2回目の攪拌工程の後、さらに30～60分間攪拌します。溶液を遠心分離してペレット化します。今回は10,000 ×gで遠心し、上清を捨てて、沈殿物を0.25 M 酢酸で再溶解させ、4 °Cでさらに24時間撹拌します。次に、コラーゲン溶液を、約17.5 mM 酢酸 6 Lを用いて6〜8回交換しながら透析します。透析後、コラーゲンを30,000 ×gで1.5時間遠心分離し、ペレット化させます。最後に、上清を滅菌ボトルに移し、あらかじめ冷却しておいた0.5 mM酢酸を用いてコラーゲン濃度を約2 mg/mLに調整し、氷上で保持します。まず、コンフルエントになった初代線維芽細胞が入ったT 75フラスコを3本選びます。FCSの容器を4°Cで冷却します。次に、あらかじめ調製しておいたラット尾コラーゲン75 mLを、事前に冷却した100 mLの滅菌済みガラスボトルに加えます。その後、混合物を撹拌しながら10 XMEMを9 mL加えます。0.22 N 水酸化ナトリウム 6 mL を加え、最後の 1 mL に近づいたらゆっくりと添加します。これは、最終的な色がオレンジ色からピンク色の間になるようにするためです。トリプシンで線維芽細胞を剥離させ、室温で 400 ×g で 5 分間遠心分離して細胞をペレット化します。遠心分離中に、35 mmプラスチックディッシュを準備します。ペレットを予冷したFCS 10 mLで再懸濁し、直ちに線維芽細胞をコラーゲンに加えます。混合・攪拌し、1枚の35 mmディッシュあたり約2.5 mLのコラーゲン・線維芽細胞混合液を、可能な限り迅速に分注します。気泡の混入とコラーゲンの凝固を防ぎます。ディッシュをインキュベーターに10分間置き、コラーゲンを緩いゲル状に形成させた後、各ディッシュに線維芽細胞増殖培地を1 mL加えます。次に、ピペットを使用してコラーゲン線維芽細胞マトリックスをディッシュの側面から剥がし、ディッシュを再びインキュベーターに戻します。翌日、ディッシュにFiberblast増殖培地をさらに1 mL加えます。その後、約8日間、1日おきに培地を交換してください。この期間に、各コラーゲン線維芽細胞マトリックスが直径約3.5 cmから約1.5 cmまで収縮したことを確認してから次のステップに進みます。すべてのピンセットおよび器具をエタノールで滅菌してください。次に、滅菌済みの鈍端鑷子を用いて、収縮したマトリックスを24ウェルプレートのウェルに、折りたたまれないように注意しながら慎重に移します。続いて、解析対象の細胞が入ったフラスコを選択し、トリップスナイフを用いて前述と同様に細胞をペレット化します。その後、細胞を培地で再懸濁し、細胞懸濁液1 mLをマトリックスの上に分注します。そして、細胞がマトリックス上でおよそコンフルエントになるまで、収縮したマトリックスをインキュベーターで培養します。三脚作成用にオートクレーブ滅菌したステンレス製グリッドを事前にカットしておき、使用の約3～5日前に、滅菌済みグリッドを6 cmプラスチックディッシュに入れ、グリッドが浸るまで十分な量の増殖培地を加えます。気液界面（air liquid interface）の作成は、本手順において最も繊細な工程です。マトリックスをグリッド上に配置した後、マトリックスが底部から部分的に浸漬され、底部から供給される状態になるよう、培地を慎重に吸引除去する必要があります。これにより化学走性勾配が形成され、上層の細胞がマトリックス内へと浸潤し始めます。このセットアップにおける細胞の挙動は、21日以上の期間にわたって評価することが可能です。グリッド上にマトリックスを配置します。次に、マトリックスの底部が培地に接触し、かつ培地に浸らない状態になるまで、緩やかに培地を吸引してください。気液界面が、こちらのシーンのような状態になっているはずです。次に、浸潤させたマトリックスを平らな表面に移動させます。新しいメスでマトリックスを半分に切り、メスでマトリックスを持ち上げて4% PFAに転送します。以下の2つの図において、マトリックスを室温で一晩固定します。膵管腺癌細胞（P DAC細胞）をオルガノタイプマトリックスの上に積層させました。最初の図では、非浸潤性のP dac細胞がマトリックス上の層として確認できます。一方、2番目の図では、マトリックスに浸潤した浸潤性P dac細胞が観察されます。ここでは、線維芽細胞によって収縮したコラーゲン性真皮成分の上に層状の表皮を示す生体皮膚等価物が確認できます。緑色で示された浸潤性PD細胞が、赤色で示された線維芽細胞と相互作用している様子が見られ、これによりPDX細胞のオルガノタイプマトリックスへの浸潤が促進されます。ここで再び緑色で示されている浸潤性のPD細胞が、第二高調波発生を用いてイメージングされたコラーゲンマトリックス（紫色で表示）内に可視化されており、マトリックスの分解部位は紫色のマトリックス内の暗い穴として見えます。この図C 8 1 61では、線維芽細胞によって収縮したコラーゲン性真皮等価物へと浸潤するメラノーマ細胞が示されており、同時に、このアッセイにおける蛍光タンパク質の基本プロセスの挙動も観察しています。また、このアッセイを免疫組織化学染色と併用することで、細胞増殖マーカーや細胞生存率の違いなどを調べることも可能です。

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中脳ドーパミン系と線条体からの外植片は、のためにコラーゲンマトリックスアッセイで使用されている...

三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化

この記事では蛍光さらなる修正と3D細胞培養のライブイメージングの両方に使用することができコラーゲンにラベルを付ける方法を紹介します。また、3D環境で培養された細胞の内因性細胞骨格タンパク質を可視化するために最適化されたプロトコルを提供する。...

3Dで浸潤癌細胞の細胞骨格組織を明らかにする

細胞移動は、癌のような創傷治癒および免疫応答、および病態生理学的過程として、生理の茄多に関与している生物学的な現象である。 3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、3D生理的環境における内の異なる細胞型の遊走特性を分析するための多目的なツールである。...

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

機械的性質と細胞外マトリックスの微細構造は強く、細胞の3D移行に影響。 インビトロ方法は、集団及び個々の細胞レベルの両方での生物物理学的に可変環境における時空間細胞移動の挙動を研究するために、記載されている。...

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

コラーゲンは、ECMのコアコンポーネントであり、移行からの分化・増殖に至るまで、いくつかの細胞プロセスに不可欠な手がかりを提供します。 3Dコラーゲンハイドロゲル内の細胞を埋め込むためのプロトコル、およびPDMSマイクロチャネルを使用して、ランダム化または整列コラーゲンマトリックスを生成するための、より高度な技術がここに提供します。...

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配​​列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の​​複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。...

細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

ここでは、3Dマトリックスで軸を成長させる行動を分析し、その自然な発達を模倣する方法を提供する。...

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

このプロトコルは、流体の流れ方向に沿って形状を変化させるマイクロ流体チャネルを使用して、3Dコラーゲンヒドロゲル(厚さ&lt;250 μm)内の繊維を整列させるための伸長ひずみ(伸張)を生成する方法を示します。結果として得られるアライメントは数ミリメートルにまたがり、伸張ひずみ速度の影響を受けます。...

長距離繊維配向によるマイクロエンジニアリング3Dコラーゲンヒドロゲル

ここでは、IDG-SW3細胞を3次元(3D)細胞外マトリックスで培養するためのプロトコルを紹介します。...

3次元細胞外マトリックスでのIDG-SW3細胞培養

このプロトコルは、細胞外マトリックスのハイドロゲルスキャフォールド上でA549肺胞上皮細胞およびMRC-5肺線維芽細胞からオルガノイドを生成し、その後3Dコラーゲンゲルに埋め込み、細胞伸縮バイオリアクターを用いた機械的負荷曝露を行って肺胞機械生物学を調査する方法を概説します。...

機械式細胞伸縮バイオリアクターを用いた3Dコラーゲン埋め込みA549/MRC-5肺胞オルガノイドの生成

学ぶ 3次元コラーゲンIマトリックスを用いた器官型アッセイ法。ラット尾腱由来コラーゲンと線維芽細胞で組織様環境を構築し、腫瘍細胞の浸潤・転移を可視化する技術です。蛍光顕微鏡と免疫組織化学染色で細胞挙動を解析できます。

器官型コラーゲンIアッセイ：3次元コンテキストでのセルの挙動を評価するための可鍛性プラットフォーム

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