器官型コラーゲンIアッセイ：3次元コンテキストでのセルの挙動を評価するための可鍛性プラットフォーム

この手順の全体的な目標は、細胞機能を研究するための3次元コラーゲンマトリックスのような組織を確立することです。これは、最初にラットの尾の腱からコラーゲンを抽出することによって達成されます。次に、線維芽細胞の存在下でコラーゲン繊維が再構成され、線維芽細胞がコラーゲンゲルを収縮させることができます。

3番目のステップでは、腫瘍細胞が最終ステップのマトリックスの上に座ります。マトリックスは金属グリッドの上でインキュベートされ、腫瘍細胞がマトリックスに浸潤できるように空気液体界面を形成します。最終的には、免疫組織化学染色と蛍光顕微鏡法を実施して、腫瘍細胞の浸潤や異なる細胞タイプ間の相互作用など、マトリックス合成細胞の遊走を解析できます。

したがって、この方法は、浸潤と転移、および腫瘍の発生を調べるのに最適です。複雑な3次元Sでは、分化、細胞の生存、細胞の成長などを見ることができます。しかし、特に、浸潤の主要なイベント中に腫瘍細胞が間質とどのように相互作用するかを調べることができます。

がん転移自体の最も初期の部分の1つ 皮膚インプラントから線維芽細胞培養を確立するため。まず、ペニシリン、ストレプトマイシン、および真菌ゾーンを添加したMEMを数滴、ペトリ皿の底に置きます。次に、人間の前腕から取得した4ミリメートルパンチ生検を皿に入れます。

次に、最後に、24番のメスの刃をペトリ皿の底に揺らして、生検を細かく刻みます。組織スラリーを25cm四方の組織培養フラスコに入れます。次に、一次線維芽細胞増殖培地を組織上に注ぎます。

フラスコの表面を覆うには十分ですが、組織が浮くには不十分です。フラスコを5%CO2の加湿雰囲気下で摂氏37度で3日間インキュベートし、さらに3日後に3ミリリットルの一次ファイバーブラスト成長培地を追加します。潜伏。新鮮な一次ファイバーブラスト成長培地で培地を交換します。

細胞がほぼコンフルエントな場合は、新鮮な培地で新しいフラスコに1〜4分割できます。ラットの尾を70%エタノールで洗い、0.5モル酢酸のボトルを摂氏4度で冷やして、ラットの尾から腱を取り除きます。まず、個々のラットの尾から皮膚を取り除きます。

次に、尾の近位領域のコアから腱を切り離します。最後に、歯の鉗子を使用して、尾の遠位領域に向かって腱を取り除きます。腱を取り除いた後、ガラス製の円錐形フラスコに250ミリリットルの0.5モル酢酸を追加します。

腱を抽出してから48時間、摂氏4度で攪拌することにより、酸250ミリリットルあたり1グラムの腱を抽出します。酸と腱の溶液を7,500倍Gで摂氏4度で30分間遠心分離し、次にペレットを廃棄します。次に、上清に10%の重量/体積のNACLを等量加え、2回目の攪拌ステップ後、さらに30〜60分間攪拌します。

溶液をペレット化します。今回は10, 000回で、Gは、上清を捨て、赤は4°Cで24時間攪拌しながら0.25モル酢酸に沈殿物を溶解します。次に、約17.5ミリモル酢酸の6リットルの6〜8回の変化に対してコラーゲン溶液を透析します。

透析ペレットの後、コラーゲンを30、000倍Gで1.5時間。最後に、スープラナチンを滅菌ボトルに移し、コラーゲン濃度を予め冷やした0.5ミリモル酢酸で1ミリリットルあたり約2ミリグラムに調整し、コラーゲンを氷上に保ちます。まず、コンフルエントな一次線維芽細胞のT 75フラスコを3つ選択します。

FCSの容器を摂氏4度で冷まします。次に、前に調製したラットテールコラーゲン75ミリリットルを、100ミリリットルのガラス製予冷滅菌ボトルに加えます。次に、混合物を攪拌しながら、9ミリリットルの10XMEMを追加します。

0.22の通常の水酸化ナトリウムを6ミリリットル追加し、最後のミリリットルに近づくと減速します。最終的な色がオレンジとピンクの間になるようにします。トリプシンは線維芽細胞を観察し、次に細胞をGの400倍で室温で5分間ペレット

スピン中に36 35ミリメートルのプラスチック皿を組み立てます。ペレットを10ミリリットルの予冷済みFCSに再懸濁し、すぐにコラーゲンに線維芽細胞を加えます。35mm皿あたり約2.5ミリリットルのコラーゲン線維芽細胞混合物をできるだけ早く混合して攪拌します。

泡を避け、コラーゲンをセットします。ディッシュをインキュベーターに10分間入れてコラーゲンがルーズゲルを形成するのを待ってから、各ディッシュに1ミリリットルのファイバーブラスト成長培地を加えます。次に、ピペットを使用して皿の側面からコラーゲンファイバーブラストマトリックスを取り外し、皿をインキュベーターに戻します。

翌日、さらにミリリットルのFiberblast成長培地を皿に加えます。その後、約 8 日間、1 日おきにメディアを交換します。この間、各コラーゲン線維芽細胞マトリックスは、この次のステップを開始する前に、直径約3.5センチメートルから約1.5センチメートルに収縮し、すべての鉗子と機器をエタノールで滅菌する必要があります。

次に、鈍い滅菌鉗子を使用して、収縮したマトリックスを24ウェルプレートのウェルに静かに移動させ、マトリックスが折りたたまれないようにします。次に、研究する細胞のフラスコを選択し、トリップナイフで細胞をペレット化し、前と同じように細胞をペレット化し、細胞懸濁液の1ミリリットルの培地プレートに細胞を再懸濁し、細胞がマトリックスの頂上までほぼコンフルエンスするまで、収縮したマトリックスをインキュベーターに置きます。使用場所の前に三脚の作成のために事前にカットされたステンレス鋼のグリッドをオートクレーブしてから約3〜5日後、6センチメートルのプラスチック皿の滅菌グリッドは、グリッドを覆うのに十分な成長培地を追加します。

気液界面の作成は、この手順の最もデリケートな部分です。マトリックスをグリッド上に配置し、マトリックスがまだ部分的に底部から沈み、底部から供給されるように、その媒体を穏やかに吸引する必要があります。これにより、走化性勾配が作成され、上部の細胞がマトリックスに侵入し始めることができます。

このセットアップでの細胞の挙動は、21日以上にわたって評価できます。グリッド上に行列を配置します。次に、マトリックスの底部がメディアに接触しているが、メディアに覆われていないまで、メディアを静かに吸引します。

気液のインターフェースは、このシーンのようになります。次に、浸潤したマトリックスを平らな面に移します。新しいメスでマトリックスを半分に切り、メスでマトリックスを持ち上げて4%PFAに移します。

マトリックスを室温で一晩固定する以下の2つの図は、器官型マトリックスの上に膵管腺癌細胞またはP DAC細胞を重ねたものです。最初の図では、マトリックスの上の層に非侵襲的なP dac細胞が見られますが、この2番目の図では、マトリックスに浸潤した侵襲的なP dac細胞がここで観察されていますが、ここでは、線維芽細胞が収縮したコラーゲン性真皮成分上に層状の表皮を示す生きた皮膚相当物が見られます。緑色の浸潤性PD細胞は、赤色の線維芽細胞と相互作用し、PDX細胞の器官型マトリックスへの浸潤を促進することが観察されます。

ここで再び緑色で示されている浸潤性PD細胞は、第2高調波発生を使用して画像化されたコラーゲンマトリックス内で視覚化され、マトリックス劣化の紫色で示されているサイトは、紫色のマトリックス内の暗い穴として見えます。この図では、線維芽細胞に侵入する黒色腫細胞が収縮したコラーゲン性真皮当物が示されているだけでなく、このアッセイ中の蛍光タンパク質の基本的なプロセスの挙動を見ています。また、このアセイを免疫組織化学染色と併用して、細胞増殖マーカーや細胞生存率の違いなどを調べることもできます。