3Dハイドロゲルシステムにカプセル化された細胞の免疫染色

天然の細胞外マトリックス環境を模倣したヒドロゲルシステムにカプセル化された哺乳類細胞を含むマルチウェルプレートを取ります。

培地を取り除きます。固定バッファーで処理してタンパク質を架橋し、細胞の完全性を維持します。

細胞膜を透過性化するために界面活性剤を含む溶液を加えます。

ブロッキング溶液を導入して、後続のステップで非特異的抗体結合を防ぎます。

細胞に入り、細胞質中間フィラメントおよび標的転写因子に特異的に結合する一次抗体カクテルを追加します。

結合していない抗体を除去します。蛍光標識二次抗体と核染色を導入して、DNAを蛍光標識します。

結合していない分子を取り除きます。

封入培地を使用してヒドロゲル培養物をスライドに接着します。

共焦点顕微鏡を使用して、免疫染色細胞を観察します。

まず、各ウェルから培地を吸引します。次に、1ミリリットルの温かいDPBSでウェルを洗浄します。洗浄が完了したら、各ウェルに750マイクロリットルの固定液を加えます。次に、24ウェルプレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルから固定液を吸引し、固定液を有害廃棄物容器に廃棄します。次に、1ミリリットルのDPBSをサンプルに加え、すぐにDPBSを有害廃棄物容器に廃棄します。

次に、750マイクロリットルの透過処理溶液を加えて、ロッカー上で室温で毎分15回転でサンプルを1時間透過処理します。1時間後、透過処理溶液を吸引し、750マイクロリットルのブロッキング溶液をサンプルに加えます。サンプルをロッカーの上に室温で3時間放置します。次に、目的の一次抗体を抗体希釈液で希釈します。

次に、各サンプルに500マイクロリットルの抗体溶液を加えます。サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、一次抗体溶液を吸引します。次に、サンプルをPBSTで室温で毎分15回転で1時間

3回洗浄します。

次に、適切な二次抗体と 5 mg/ml の DAPI ストック溶液を希釈して、最終濃度を 2.5 マイクログラム/ミリリットルにします。次に、各サンプルに500マイクロリットルの溶液を加えます。次に、アルミホイルを使用して24ウェルプレートを覆い、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、二次抗体溶液を吸引し、サンプルをPBSTで3回、ロッカー上で室温で30分間洗浄します。次に、スライドガラスの表面に硬硬化した封入剤を一滴垂らし、サンプルを封入剤の上に置きます。最後に、マニキュアを使用してサンプルをガラスカバースライドに密封し、汚染やサンプルの移動を防ぎます。