ウイルス由来ペプチド修飾抗体複合体の細胞内分布の評価

着したヒト赤芽細胞から始めます。

ウイルス由来のペプチド修飾抗体複合体を導入します。これらの複合体には、ウイルス由来の核局在配列(NLS)とコール酸残基が含まれています。

インキュベーション中、抗体複合体は細胞表面受容体と相互作用し、エンドソーム内で内在化します。

抱合体中のコール酸はエンドソームコンパートメントから脱出するのに役立ち、細胞内蓄積を可能にし、輸送タンパク質とNLSはそれらの核局在を促進します。

トリプシンとEDTA含有バッファーを導入して細胞を分離し、表面結合した複合体を除去します。

トリプシン活性を阻害するために血清が豊富な培地を添加します。

遠心分離機で細胞を回収します。それらを固定して透過化します。

赤色蛍光色素標識二次抗体を導入し、局所的な複合体に結合して洗浄します。

核染色染料で処理します。

共焦点顕微鏡で観察し、さまざまな平面深さで画像をキャプチャします。

画像処理後、細胞質と核内に小さな緑色の蛍光病巣を示し、抗体複合体の細胞内分布を確認します。

標的TF-1a細胞を200ナノモルの7G3-コール酸抗体複合体で処理します。修飾対照モノクローナル抗体で処理した細胞を含めます。5 x 10⁶抗原陽性細胞を複合体とともに摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、上清を取り出し、1ミリリットルの氷冷PBSを使用して細胞を3回洗浄します。

新鮮な培地を加え、細胞を摂氏37度でさらに1時間インキュベートします。次に、0.25%トリプシンとEDTAを含む0.5ミリリットルのPBSを加え、細胞を摂氏37度で最大30分間インキュベートします。次に、10%FBSを含む1.5ミリリットルのRPMI-1640培地を使用してトリプシンを中和します。

細胞を500回gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、0.5ミリリットルの氷冷PBSを使用して細胞を再度3回洗浄します。0.5ミリリットルの1%PFAと1%スクロースをPBSに細胞に加え、氷上に30分間置いて固定します。

次に、0.5ミリリットルの氷冷PBSを使用して細胞を3回洗浄し、サンプルを250回gで5分間遠心分離します。次に、PBS中の0.15%Triton X-100を細胞に加え、氷上で5分間透過処理します。次に、氷冷PBSで細胞を洗浄し、遠心分離を繰り返します。

AlexaFluor 647に結合した抗マウスFc二次ポリクローナル抗体を1ミリリットルあたり2マイクログラムを含む0.1ミリリットルのPBSに細胞を懸濁し、サンプルを室温で暗所で1時間インキュベートします。細胞を250倍gで5分間遠心分離し、0.5ミリリットルの氷冷PBSを使用して細胞を3回洗浄します。

次に、細胞を0.5ミリリットルのPBSに再懸濁します。1ミリリットルあたり10マイクログラムのヨウ化プロピジウムを細胞に加えます。次に、サンプルをガラスカバーガラスで覆う前に、封入媒体を使用して1 x 10⁵セルをスライドガラスにマウントします。Plan Apo 60X油浸対物レンズ、開口数1.42で、倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡で細胞を調べます。

488ナノメートルのアルゴンレーザーと600〜650ナノメートルに設定されたスペクトル走査プリズムを使用してPI蛍光を検出します。AF 647蛍光には、633ナノメートルのヘリウムネオンレーザーと650〜700ナノメートルに設定されたスペクトル走査プリズムを使用します。P1とAF 647から、1024×1024ピクセルの画像を1024×1024ピクセルで連続して収集し、セル厚全体にわたって0.5ミクロン間隔で2倍のライン平均で撮影します。イメージをZ投影として表示します。

細胞を分析するには、細胞質内の細胞内蛍光がグループ化されて細胞表面近くにあるのか、それとも拡散して均一であるのかを評価して記録します。また、細胞ごとの相対的な蛍光強度を評価します。