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海馬に両側に埋め込まれた2つのガイドカニューレで目覚めているラットを取ります。
カニューレは、それぞれアミロイドベータ抗体またはAβ特異的抗体および対照抗体を含む皮下埋め込み浸透圧ポンプに接続されています。
ポンプ内の抗体濃度が高いと、周囲の組織から外側の半透膜を介して水の拡散が誘導され、浸透圧層が拡張されます。
この拡張により抗体リザーバーが圧縮され、制御された抗体放出が促進されます。
輸液ポンプに接続された滅菌水で満たされたカテーテルに2つの内部カニューレを取り付けます。
カニューレを水で満たします。
次に、少量の空気を吸引して気泡を作ります。
次に、カニューレを神経毒性Aβオリゴマー、Aβペプチドの可溶性凝集体で満たします。
内部カニューレをガイドカニューレに挿入します。ポンプを始動してオリゴマーの制御された送達を行い、気泡を使用して逆流を防ぎ、注入速度を追跡します。
必要な期間、オリゴマー注射を繰り返し投与します。
このモデルは、Aβオリゴマーと抗体の相互作用を研究する準備ができています。
設置の 1 日前に、製造元の指示に従って浸透圧ポンプに 6E10 抗体またはコントロール IgG1 抗体を充填してください。ポンプを滅菌蒸留水に入れ、一晩摂氏37度に保ち、ポンプを作動させます。
ラットを3%イソフルランで麻酔し、肩甲骨の間を剃ったら、2%グルコン酸クロルヘキシジンと2%イソプロピルアルコールの溶液で皮膚を消毒します。肩甲骨の間にメスで2センチの切開をした後、ガイドカニューレに接続されたPE-50カテーテルを見つけます。
次に、歯科用セメントを含むPE-50カテーテルの端をメスで切断します。浸透圧ポンプを PE-50 カテーテルに接続し、ポンプとカテーテルの接合部に歯科用セメントを追加して接続を固定します。最後に、4/0縫合糸で皮膚をしっかりと縫い合わせます。動物を温かいヒートパッドの上のケージに戻し、イソフルラン麻酔から目覚めるのを監視します。
以前に報告されたようにアミロイド-ベータオリゴマー溶液を調製した後、注入する前に溶液を室温で1時間動的かつ自発的に凝集させます。次に、各注射器に 5 マイクロリットルの滅菌蒸留水を入れます。
次に、PE-50カテーテルを2本、メスで長さ約60センチに切断します。21ゲージの針を取り付けた2つの1ミリリットルの注射器を使用して、両方のカテーテルに滅菌蒸留水を満たします。1 ミリリットルの注射器を所定の位置に残したまま、各カテーテルの一方の端で自由端をハミルトン注射器に接続します。1ミリリットルの注射器を取り外し、カテーテルに気泡がないことを確認します。
PE-50カテーテルの端に内部カニューレを挿入します。ハミルトン注射器を使用して、各内部カニューレを最大1マイクロリットルまで満たし、ピストンを2マイクロリットルのマークまで引き戻して気泡を作ります。
次に、アミロイド-ベータオリゴマー溶液を、最小限の付着の先端を使用して上下にピペッティングして混合します。混合中に気泡が発生しないようにしてください。次に、ピストンを3.5マイクロリットルに引き戻して、両方の内部カニューレに1.5マイクロリットルのアミロイドベータオリゴマー溶液を満たします。
次に、両方のカテーテルの気泡の前後の線に印を付けます。これは、進行中の注入のチェックポイントとして機能します。目覚めているネズミを寄り添い、頭を固定します。2ガイドカニューレからダミーカニューレを取り外し、事前に準備した内部カニューレをガイドカニューレに挿入します。それらが完全に挿入され、ガイドカニューレのベースにしっかりと固定されていることを確認します。次に、ラットを寄り合いから解放し、ケージに戻して取り扱いのストレスを制限します。
輸液ポンプの電源を入れ、1マイクロリットルのアミロイドベータオリゴマー溶液を毎分0.1マイクロリットルの速度で注入します。注入中は、シリンジピストンが3.5マイクロリットルから2.5マイクロリットルに移動すること、および両方のPE-50カテーテル内の気泡が連続的に移動することを確認します。ラットをチェックして、カテーテルがねじれていないことを確認してください。
アミロイドベータオリゴマー溶液の効率的な拡散を可能にするために、注入後さらに5分間内部カニューレを所定の位置に置いておきます。注入後、ラットを寄り添いホールドに戻し、注入された溶液の逆流を防ぐために内部カニューレとキャップ付きガイドカニューレを取り外します。ガイドカニューレのアングルアームの手前で止まったダミーカニューレを配置します。最後に、動物をケージに戻します。