食細胞による抗体依存性細胞貪食作用を測定するためのin vitroアッセイ

目的の抗原に結合した蛍光標識マイクロスフェアを取ります。固定化された抗原は抗原特異的抗体に結合しています。

非食作用性リンパ球、食作用顆粒球、および単球を含む白血球を追加します。生理学的条件下で混合物をインキュベートします。

固定化抗体のFc領域は、食細胞上のFc受容体に結合し、抗体依存性細胞食作用(ADCP)を引き起こします。

遠

心分離機で細胞をペレット化し、内部化されていないミクロスフェアを含む上清を廃棄します。

死んだ細胞に侵入する生存率染色剤を追加し、蛍光標識します。

遠心分離機で細胞をペレット化し、上清を除去します。

白血球に結合する蛍光標識抗体を追加します。

遠心分離機で上清を廃棄し、細胞を固定します。

フローサイトメトリーを使用して、まず、生存率染色陽性の死細胞を除去します。

次に、生存可能な白血球を選択し、粒度と散乱特性に基づいて顆粒球、単球、リンパ球を区別します。

マイクロスフェア陽性食作用細胞の蛍光強度を測定して、ADCP活性を定量化します。

ADCPアッセイの場合、調製したADCPプレートを素早く反転させて最終遠心分離後に上清をデカントし、5 x 10⁴個の新鮮な母乳細胞を200マイクロリットルのPBSとBSAに加え、摂氏37度で2時間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、細胞を遠心分離し、実証されているように、ペレットを200マイクロリットルの新鮮なPBSで2回洗浄します。最後の洗浄後、細胞を1ミリリットルあたり0.5マイクログラムの固定可能な生存率染色剤、ウェルあたり450マイクログラム、および50マイクロリットルのPBSで室温で30分間染色し、光から保護します。

インキュベーションの最後に、示されているように、新鮮なPBSで2回洗浄するために細胞をペレット化し、光から保護した室温で30分間、目的の白血球マーカーの細胞を染色します。インキュベーションの最後に、遠心分離によって細胞を収集し、洗浄ごとに200マイクロリットルの1%BSAとPBSで細胞を2回洗浄します。

最後の洗浄後、ペレットをウェルあたり200マイクロリットルの0.5%ホルムアルデヒドに、光から保護して室温で30分間固定します。細胞サンプルのフローサイトメトリー分析では、ハイスループットプレートリーダーを備えたフローサイトメーターを設定して、175マイクロリットルのサンプルを採取し、ウェルあたり5,000個の細胞を収集します。

初期ゲートを実行して、前方散乱図と側面散乱図でダブレットとデブリを除去します。サイドスキャッター対生存率染色プロットを使用して死細胞を除去し、サイドスキャッター対CD45プロットを使用して主要な白血球クラスを区別します。

すべてのCD45陽性細胞、または目的の白血球サブセットごとに、結合ビーズの適切な蛍光色素チャネルのヒストグラムで