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ヒト腸内細菌の懸濁液を含むチューブを取ります。
ヒトノロウイルス様粒子(VLP)を追加します。VLPには無傷のウイルスカプシドが含まれていますが、ゲノムRNAが欠如しているため、ヒトには感染しません。
インキュベーション中、VLPカプシドタンパク質は細菌表面に発現する特定の炭水化物に結合し、VLP細菌複合体を形成します。
遠心分離して複合体をペレット化し、結合していないVLPを廃棄します。
タンパク質含有ブロッキング溶液を導入して非特異的抗体結合部位をブロックし、後続のステップでのバックグラウンド染色を減らします。
蛍光標識VLP特異的抗体を加え、インキュベートします。
抗体はVLPキャプシド上の標的部位に結合し、VLP細菌複合体を標識します。
複合体をペレット化するための遠心分離機。結合していない抗体を廃棄し、ペレットをフローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。
フローサイトメーターを使用して、VLP細菌複合体から発せられる蛍光シグナルを検出し、サンプル中の結合細菌の割合を定量できます。
原稿に記載されているように試薬、抗体、および細菌を準備した後、すべての材料をBSL IIバイオセーフティキャビネットに組み立てます。
ヒトノロウイルスのウイルス様粒子はBSL II病原体としてリストされており、VLPを使用して行われるすべての作業は、認定されたバイオセーフティキャビネットで実施する必要があります。
10マイクログラムのヒトノロウイルスVLPを細菌の各チューブに加え、ピペッティングで完全に混合します。チューブを摂氏37度で一定の回転で1時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを10,000倍gで5分間遠心分離します。
上清を吸引して廃棄し、細菌ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。洗浄ステップを1回繰り返した後、チューブを10,000倍gで5分間再度遠心分離します。上清を廃棄し、VLP細菌ペレットを150マイクロリットルの5%ブロッキングバッファーに再懸濁します。
よく発生するエラーは、チューブが交換され、間違った治療が追加されることです。これを防ぐために、すべてのチューブを正しい治療に対応するラインに並べ、チューブに一度に1つの治療を追加します。
細菌サンプルごとに、希釈したヒトノロウイルスG2抗体を50マイクロリットル調製します。5%ブロッキングバッファーを使用して、大腸菌症例サンプルの抗体を1〜125に希釈します。同じ希釈比を使用して、各細菌サンプルに対して50マイクロリットルの希釈アイソタイプ抗体を調製します。各アタッチメントアッセイサンプルを350マイクロリットルのアリコートに分割し、1.5ミリリットルの清潔な遠心分離管に移します。
未染色のコントロールを作成するには、各細菌サンプルからの最初のアリコートに50マイクロリットのブロッキングバッファーを追加します。染色したサンプルの場合、50マイクロリットルのG2抗体希釈液を2番目のアリコートセットに加えます。希釈したアイソタイプ抗体を50マイクロリットルのアリコート3セットに追加して、アイソタイプコントロールを作成します。
すべてのサンプルを氷上および暗所で30分間インキュベートします。次に、すべてのサンプルを10,000倍gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、各サンプルを150マイクロリットルのFCSBに再懸濁します。ここでも、すべてのサンプルを10,000倍gで5分間遠心分離します。ここでも、上清を廃棄し、サンプルを100マイクロリットルのFCSBに再懸濁します。
最後にもう一度サンプルを遠心分離し、上清を廃棄した後、サンプルを150マイクロリットルのFCSBに再懸濁します。各サンプルを 400 マイクロリットルの FCSB を含むチューブに移し、総容量は 550 マイクロリットルになります。フローサイトメトリーで分析されるまで、サンプルを摂氏4度で保存します。