トランスジェニック線虫におけるマイトファジーを検出するためのIn vivoアッセイ

ミトコンド

リア膜の外側タンパク質である緑色の蛍光色素タグ付きDCT-1と、食体膜タンパク質である赤色蛍光色素タグ付きLGG-1を発現する体壁筋細胞を持つトランスジェニック線虫を取り上げます。

マイトファジー誘導薬を含む増殖培地の上にワームを置きます。

この

薬は細胞のミトコンドリアに損傷を与え、マイトファジーまたは損傷したミトコンドリアの選択的クリアランスを開始します。

損傷したミトコンドリア上のDCT-1はユビキチン化とリン酸化を受け、食胞膜上のLGG-1との相互作用を促進します。

食体はミトコンドリアの周囲に拡張して、リソソーム分解を標的とするオートファゴソームを形成します。

線虫を顕微鏡スライド上の麻酔薬に置いて固定し、カバーガラスを置きます。

蛍光顕微鏡下で、筋細胞内の黄色い斑点を視覚化し、緑色の蛍光を発するDCT-1と赤色の蛍光を示すLGG-1の共局在を示します。これはマイトファジーの発生を確認します。

1日目に、体壁筋細胞でDCT-1::GFPとDsRed::LGG-1の両方を発現するトランスジェニック動物のL4幼虫を摘み取り、OP50播種線虫増殖培地プレートに置きます。少なくとも3つのプレートを使用して、各3.5センチメートルのプレートに5〜10匹のワームを置きます。終了したら、線虫を摂氏20度でインキュベートします。

次に、5日目に、15〜20匹のL4トランスジェニック幼虫を選択し、それらを新鮮なOP50播種プレートに移すことにより、線虫を同期させます。実験条件ごとに少なくとも 5 枚のプレートを使用します。7日目に、マイトファジーに影響を与える目的の薬物用のビヒクルプレートの一部と、ポジティブコントロールとして使用するビヒクルプレート

の一部を準備します。

次に、大腸菌を播種したプレートを222マイクロワット/センチメートルの強度で15分間UV光にさらし、プレート上のマイトファジー誘導化合物が細菌によって代謝されないようにします。次に、目的の化合物を10マイクロリットルでシードプレートの上部に加え、ネガティブコントロールとして同量の化合物ビヒクルをビヒクルプレートに追加します。

マイトファジー誘導のポジティブコントロールのために、ミトコンドリア毒物であるパラコートを追加します。溶液が表面全体を切断するまでプレートをそっと回転させ、蓋を閉めて室温で少なくとも1時間プレートを乾燥させます。乾燥したら、10〜20匹の2日齢の成体トランスジェニック動物をプレートに移します。摂氏20度で2日間インキュベートします。

9日目に、2%アガロースパッドを準備し、パッドあたりM9に20ミリモルレバミゾールを1滴加えます。トランスジェニック動物をM9-レバミゾール滴に置いて、イメージングのために固定化します。次に、ドロップの上にカバーガラスをそっと置きます。サンプ