タンパク質バイオマーカー検出のためのキャピラリー電気泳動イムノアッセイ

疾患関連タンパク質バイオマーカーを検出するには、イムノアッセイプレートを採取します。

プレートには、サイズベースのタンパク質分離に必要なプレフィルド分離マトリックスとスタッキングマトリックスが含まれています。

タンパク質とイムノアッセイ試薬を別々のプレートウェルにロードします。

CEI アナライザー内で実行を開始します。分析装置のキャピラリーカートリッジはマトリックスを吸引して、各キャピラリー内にゲルを形成します。

次に、毛細管はタンパク質を吸引します。電気泳動中、タンパク質は分子量に基づいて移動および分離します。

分析装置は紫外線を導入し、毛細血管内のタンパク質を固定します。

洗浄バッファーは、マトリックスと結合していないタンパク質を除去します。その後、ブロッキングバッファーが流入し、非特異的な相互作用部位をブロックします。

この分析装置は、バイオマーカーに結合する一次抗体を導入し、続いて一次抗体と相互作用するペルオキシダーゼ結合二次抗体を導入します。

洗浄

してから化学発光基質を加えます。ペルオキシダーゼは基質を酸化し、発光を発します。

発光強度を測定し、バイオマーカー検出用のタンパク質標準と比較します。

ALS患者および健常者から100マイクロリットルのヒト血小板溶解物を採取した後、キャピラリーレイアウトとサンプル調製のために社内で生成したテンプレートに記入します。サンプル混合物調製テーブルは動的であり、ソースから除去する量を自動的に計算します。室温に置いておく必要がある標準パックを除き、すべてのアッセイ試薬を氷の上に置きます。

蛍光マスターミックスを調製するには、40マイクロリットルの脱イオン水をDTTの透明なチューブに加え、20マイクロリットルの10Xサンプルバッファーと、調製した20マイクロリットルの400ミリモルDTT溶液をアッセイキットのピンク色のチューブに加えます。

ビオチン化ラダーを調製するには、16マイクロリットルの脱イオン水、2マイクロリットルの10Xサンプルバッファー、および2マイクロリットルの調製した400ミリモルDTT溶液をキットに付属の白いチューブに加えます。穏やかに混合した後、変性する前にラダー溶液を200マイクロリットルのPCRチューブに移します。

1.5マイクロリットルの10Xサンプルバッファーと148.5マイクロリットルの脱イオン水を600マイクロリットルの微量遠心チューブに加えます。チューブを氷の上に置く前に、ボルテックスして混合します。表に示すように、目的の抗体を希釈液に直接加え、ピペットチップを複数回洗い流して均一な抗体溶液を得る。

キャピラリーサンプルミックスを調製するには、すべてのPCRチューブを開き、表に示すように、リバースピペッティング技術を使用して、1.6マイクロリットルの蛍光5Xサンプルバッファーを各チューブに加え、バッファーが添加されたらすぐに各チューブを閉じます。すべてのバッファーが添加されたら、すべてのチューブを開き、表に示すように0.1倍のサンプルバッファーを容量で追加し、バッファーが追加されたらすぐに各チューブを閉じます。

次に、すべてのチューブを開き、表に示すようにタンパク質サンプルを追加し、すぐに各チューブキャップを閉じます。すべてのサンプルが追加されたら、すべてのチューブを卓上遠心分離機で短時間遠心分離します。ボルテックスして混合し、サンプルを再度遠心分離します。

2回目の遠心分離の最後に、すべてのチューブを加熱された蓋付きのサーモサイクラーに入れ、示された条件下でサンプルを変性させます。変性が終わったら、サンプルを遠心分離、混合、遠心分離し、再び遠心分離し、すべてのチューブを氷上のチューブラックに入れます。

図をガイドとして使用して、10マイクロリットルのストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼをウェルD1に加え、10マイクロリットルの適切な二次抗体をウェルD2〜D5に、10マイクロリットルの抗体希釈液を行列BおよびウェルC1に、ウェルC2〜C25に10マイクロリットルの適切な一次抗体を加え、PCRチューブ番号1からウェルA1に5マイクロリットルのビオチン化ラダー、 3マイクロリットルのサンプルを列A2からA25に、15マイクロリットルの新しく調製した過酸化ルミノールを列Eの各ウェルに

。

サンプル混合物と試薬を正しい順序で小さなウェルにピペットで入れることは、実験の成功に不可欠であるため、非常に慎重に行う必要があります。

次に、指定された各洗浄バッファーウェルに500マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、遠心分離によってプレート内容物をスピンダウンします。