免疫療法耐性T細胞亜集団を解析するためのマルチプレックス免疫蛍光イメージング

腫瘍微小環境に浸潤しているCD8 + T細胞を示す腎細胞癌組織凍結切片を取ります。

アセトンで処理して組織を固定し、透過性化します。余分なアセトンを取り除くために洗浄します。

アビジンを添加して内因性組織ビオチンを飽和させます。次に、ビオチンを添加して固定化されたアビジン結合部位をブロックし、非特異的相互作用を最小限に抑えます。

免疫グロブリンを含む血清を適用して免疫細胞Fc受容体をブロックし、非特異的抗体結合を防ぎます。

細胞傷害性T細胞マーカーであるCD8と、免疫療法に耐性のあるCD8+ T細胞亜集団によって発現する阻害性受容体であるPD-1およびTim-3を標的とする一次抗体カクテルを追加します。

抗CD8抗体および抗Tim-3抗体を標的とする異なる蛍光色素標識二次抗体を導入します。

抗PD-1抗体を標的とするビオチン化二次抗体と、ビオチンに結合する異なる蛍光色素標識ストレプトアビジンを追加します。

色素含有封入剤を細胞核を染色に塗布し、カバーガラスを置きます。

マルチスペクトル蛍光画像を取得して、腫瘍浸潤性CD8+ T細胞と、PD-1、Tim-3、またはその両方を発現する免疫療法抵抗性亜集団を同定します。

解凍後、ペーパータオルを使用して組織切片の周りのスライドを注意深く乾かし、疎水性バリアペンで組織を囲みます。バリアが乾いたら、サンプルを100%アセトンに5分間固定し、その後2分間自然乾燥させます。次に、スライドをTBSで10分間洗浄します。

スライドを 0.1% アビジン 3 滴で暗所で 10 分間前処理します。次に、スライドをタップまたはフリックして、組織をアビジン溶液で覆います。各サンプルに0.01%ビオチンを3滴加え、先ほど示したように、ビオチンをサンプル全体に軽くたたくかフリックし、次にTBS洗浄を行います。次に、100マイクロリットルの5%正常血清をTBS中で室温で30分間、非特異的結合をブロックします。

インキュベーションの最後に、スライドを軽くたたいて余分な血清を除去し、スライドを100マイクロリットルの目的の一次抗体カクテルで加湿チャンバーで1時間インキュベートします。抗体標識スライドをTBSTで5分間洗浄します。

乾燥後、100マイクロリットルの目的の二次抗体カクテルで細胞を加湿チャンバーで30分間標識し、続いてTBSで10分間洗浄します。乾燥した二次抗体標識スライドを100マイクロリットルの目的の三次抗体カクテルと30分間インキュベートし、最後に10分間TBS洗浄します。

洗浄の最後に、スライドを乾燥させ、DAPIを添加した封入剤でティッシュをマウントします。次に、各スライドをカバースリップで覆い、封着媒体を少なくとも2時間固めます。

スライドをスキャンするには、顕微鏡ソフトウェアを開き、画像スキャンプロトコルをロードします。最初のスライドを顕微鏡ステージにロードします。次に、コントロールバーで「露出を設定」をクリックし、飽和ではない十分な信号が得られるまで、各フィルターの露光時間を調整します。

上部パネルの [開始] をクリックし、ラボ ID フォルダーを開きます。最初のスライドの ID を入力し、[次へ] をクリックします。

視野光下でのスライドの概要を取得するには、モノクロイメージングと標本の検索をクリックします。スキャンする組織の領域を選択するには、Controlキーを押し、カーソルを使用して、4倍の倍率でスキャンする関心領域を選択または選択解除します。

各領域の蛍光赤-青-緑画像を取得するには、[低電力イメージング]をクリックします。高倍率フィールド選択の場合は、Controlキーを押して、20倍の倍率でスキャンする組織の領域に対応する少なくとも5つの関心領域を選択します。

次に、各フィールドのマルチスペクトル画像取得を取得するには、[ハイパワーイメージング]をクリックし、[データストレージ]をクリックして、画像を適切なラボIDフォルダーに保存します。