感染細胞におけるウイルスタンパク質の局在化のための免疫蛍光法

接着した宿主細胞を含むスライドから始めます。

ウイルスを追加し、宿主細胞に侵入させます。

使用済み培地を取り除きます。新鮮な培地を加えて、ウイルスタンパク質の合成と輸送を可能にします。

パラホルムアルデヒドを使用して、細胞の形態とタンパク質の位置を維持します。

活性剤分子を加えて細胞を透過性にします。

ブロッキングバッファーを適用して、非標的結合部位をブロックします。

標的ウイルスタンパク質に結合する一次抗体を追加します。結合していない抗体を除去します。

ウイルスタンパク質を蛍光タグ付けするための赤色蛍光色素結合二次抗体との重ね合わせ。結合していない抗体を除去します。

蛍光核色素含有封入剤を加えて核を染色します。

共焦点顕微鏡を使用して、赤色蛍光ウイルスタンパク質と青色蛍光宿主核の位置を観察します。

青色の領域の周りの強い赤い信号は細胞質の局在を示し、内側の強い信号は核の局在を示唆しています。

青色の領域内およびその周囲のシグナルレベルが等しい場合は、タンパク質が核と細胞質の両方に位置していることを示しています。

ウイルス感染の20〜24時間前に、5 x 10⁴ヒト胚性肺またはHEL線維芽細胞をウェルごとに4ウェル11ミリメートルの千鳥状スライドに播種し、摂氏37度で5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。

培地がこぼれないように注意しながら、細胞が均一に分布するようにスライドを完全に揺らすことが重要です。翌日、70%〜80%コンフルエント培養物の上清を、細胞あたり4〜10プラーク形成単位を含む培地-199に置き換え、スライドを摂氏37度で1時間振とうしながら置きます。

インキュベーションの最後に、上清を新鮮な増殖培地に置き換え、適切な実験的感染期間の間細胞をインキュベーターに戻します。ウイルスに感染した細胞の免疫蛍光染色では、細胞をPBSで3回素早く洗浄し、続いて200マイクロリットルのPBS中の4%パラホルムアルデヒドでウェルあたり8〜10分間インキュベートします。固定の最後に、洗浄ごとに200マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄し、ウェルあたり100マイクロリットルの0.2%非イオン性界面活性剤で細胞を5〜10分間透過処理します。

実証されているように、透過処理された細胞をPBSで3回洗浄し、各ウェルに200マイクロリットルのブロッキングバッファーを加えて、室温で1時間インキュベートします。次に、目的の一次抗体を適切な濃度で各ウェルに加え、室温で2時間インキュベーションします。

インキュベーションの最後に、新鮮なブロッキングバッファーで10分間の洗浄を3回行して結合していない一次抗体を除去し、適切な二次抗体を各ウェルに追加して、光から保護した室温で1時間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、示されているように細胞をブロッキングバッファーで3回洗浄し、続いてPBSで1回洗浄し、DAPIを添加した退色防止封入剤を各ウェルに1滴加えます。次に、スライドの上にカバーガラスを置き、透明なマニキュアでカバーガラスを密封します。

カバーガラスの取り付け中に穏やかな圧力を加えると、余分な取り付け媒体が除去され、高品質の画像を確実に取得できます。

ICP0の核分布と細胞質分布を分析するには、共焦点アプリケーションソフトウェアでプロジェクトを開き、画像を選択します。「数量」タブを開き、「ツール」メニューから「対象領域のソート」を選択します。[線を描画]を選択し、解析するセルを横切って縦線を描画します。目的のタンパク質とDAPIの両方のラインに沿った蛍光強度を示すヒストグラムが表示されます。

バックグラウンド染色に基づいて、各実験におけるタンパク質の細胞内分布を分析するために、目的のタンパク質の強度の一定の閾値を設定します。タンパク質シグナルが平均して核領域の閾値を下回っているが、DAPI境界を超えて閾値を超えている場合、タンパク質シグナルを主に細胞質内に位置するものとして分類します。

タンパク質シグナルが核全体で閾値を上回り、DAPIシグナルの境界を超えている場合は、タンパク質シグナルを核と細胞質局在としてグループ化します。タンパク質シグナルが核内の閾値を上回っているが、平均してDAPIシグナルの境界外の閾値を下回っている場合、タンパク質シグナルを核局在としてグループ化します。