ウイルス感染細胞におけるカスパーゼ媒介性ウイルスおよび宿主タンパク質の切断の評価

カスパーゼ-3を含む複数のカスパーゼを産生するウイルスに感染した哺乳類細胞から始めます。

増殖培地をコントロールウェルに加え、カスパーゼ-3阻害剤を添加した培地をテストウェルに加えます。

対照ウェルでは、カスパーゼ-3はウイルスの増殖に不可欠なウイルス核タンパク質と宿主タンパク質を認識して分解します。

試験井戸では、阻害剤が細胞に入り、カスパーゼ-3活性を阻害し、タンパク質の分解を防ぎます。

プレートから細胞を取り除きます。溶解試薬を加えて加熱して細胞溶解を誘導し、細胞内タンパク質を放出します。

両方のサンプルをSDS-ポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動してサイズに基づいてタンパク質を分離します。

電気泳動後、ゲルをブロッティングメンブレンに移します。

ウイルス核タンパク質および宿主タンパク質に対する一次抗体で膜を処理します。

一次抗体と結合する蛍光色素結合二次抗体を洗浄して重ね合わせ、蛍光バンドを生成します。

試験サンプルの蛍光が高いということは、対照と比較してカスパーゼ-3を介したウイルスおよび宿主タンパク質の切断が減少していることを示しています。

まず、MDCKまたはA549細胞を12ウェル細胞培養プレートに播種し、5%の二酸化炭素雰囲気下で摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、古い培地を細胞から取り出し、各ウェルの細胞を1ミリリットルの無血清MEMで2回洗浄します。

次に、400マイクロリットルのインフルエンザAウイルス接種物を加えて細胞に感染させ、プレートを1時間インキュベートします。インキュベーション後、ウイルス接種物を除去し、細胞をMEMで洗浄します。各ウェルに1ミリリットルの無血清MEMを加え、前のステップで示したように細胞をインキュベートします。

24時間後、1ミリリットルのシリンジプランジャーで細胞をこすって細胞を採取し、1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブを室温で12,000 gで2分間遠心分離し、上清を回収します。細胞ペレットを250マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水と遠心分離機で洗浄します。上清を取り除き、100マイクロリットルの細胞溶解バッファーを加えます。ボルテックスで混合します。

チューブを摂氏98度で10分間加熱して、細胞を完全に溶解します。次に、標準的なSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、未感染サンプルと感染サンプルから同量のタンパク質を分離します。電気泳動後、タンパク質ゲルをニトロセルロースまたはPVDFメンブレンに移し、ウェスタンブロッティングを行います。模擬処理済みおよび阻害剤処理済みの感染サンプルレーンのタンパク質レベルを比較します。