蛍光抗菌薬プローブの細菌細胞内蓄積量を測定するアッセイ

細菌サンプルを含むアッセイチューブを取ります。

試験サンプルに阻害剤分子を添加して、細菌の抗生物質流出ポンプをブロックします。

遠心分離して上清を廃棄します。

細菌細胞に入る蛍光色素結合抗生物質プローブを追加します。

対照サンプルでは、流出ポンプがプローブを細胞外培地に押し出します。

阻害剤で処理されたサンプルでは、ブロックされた流出ポンプがプローブを排出できず、プローブが蓄積します。

サンプルを遠心分離します。細胞外プローブを含む上清を廃棄します。

溶解バッファーを加え、次にリゾチームを加えて細菌の細胞壁を弱めます。

凍結融解サイクル、超音波処理、および高温曝露を実行して細胞を溶解します。

遠心機。上清をフィルター膜に移します。

プローブを含む濾液を洗浄して回収します。

濾液の蛍光強度を測定します。

阻害剤で処理された細菌サンプルの蛍光強度が高い場合は、流出機能の喪失を示唆し、細胞内プローブの蓄積につながります。

プローブ蓄積分析では、細菌株のグリセロールストックをLB寒天プレートにストリークし、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、プレートから単一のコロニーをピックアップし、摂氏37度の溶原性ブロスで一晩培養します。翌朝、一晩培養物を新鮮な培地で約50倍に希釈します。

培養物が対数期の中間に達したら、遠心分離によって細菌をペレット化し、培地をデカントします。細菌を1ミリリットルのPBSに再懸濁し、再び細菌を遠心分離します。上清をデカントし、洗浄したペレットをPBSに再懸濁し、2の600ナノメートルの光学密度にします。

10.1マイクロリットルのPBS中の10ミリモルCCCPを1ミリリットルの細菌に加え、細菌を摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、遠心分離によって細菌を収集し、ペレットを1ミリリットルの10〜100マイクロモル蛍光抗生物質溶液のPBSに再懸濁します。

摂氏37度で30分間インキュベートした後、洗浄ごとに1ミリリットルの冷たいPBSで遠心分離して細胞を洗浄します。洗浄後、180マイクロリットルの溶解バッファーと70マイクロリットルのリゾチームで細菌を溶解します。

摂

氏37度で30分後、摂氏マイナス78度で5分間、摂氏34度で15分間、それぞれ3回凍結融解します。凍結融解の最後のラウンドの後、サンプルを20分間超音波処理し、続いて摂氏65度で30分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、遠心分離によって溶解したサンプルを収集し、10キロダルトンのフィルター膜を通してチューブの内容物を濾します。洗浄ごとに100マイクロリットルの水でフィルターを4回洗浄し、各洗浄を黒色の平底96ウェルプレートの個々のウェルに分注します。次に、プレートリーダーで蛍光色素に適した励起波長と発光波長で蛍光強度を測定します。