マウス海馬ニューロンの培養技術

収穫したマウスの子犬海馬を緩衝液に入れます。

海馬を小さな断片に切り、円錐形のチューブに移します。

組織をバッファーで洗浄します。フラグメントが落ち着いたら、バッファーを取り除きます。次に、新しいバッファーとトリプシンを追加します。

インキュベーション中、タンパク質分解酵素であるトリプシンが組織の細胞外マトリックスを消化し、海馬ニューロンを緩めます。

消化された組織を緩衝液で洗浄します。

フラグメントが落ち着いたら、バッファーを取り除きます。新しいバッファーを加え、組織を繰り返しピペットで移動させて機械的に解離し、単一細胞懸濁液を得る。

未消化の組織が沈降したら、培地を含む培養プレート内のワックス支持体を備えたポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラスに細胞懸濁液を移します。

細胞は、静電相互作用によってポリ-L-リジンでコーティングされた表面に付着します。

次に、ニューロンに接着したカバーガラスを下向きに、無血清培地中の皮質グリア細胞または非ニューロン細胞を含む皿に入れます。

培養では、ワックス支持体がニューロンとグリア細胞の間の直接接触を防ぎ、グリア細胞分泌因子がニューロンの生存と成熟を促進する微小環境を作り出します。

まず、出生後の生後1日の子犬から6〜8個の海馬を、シャーレでHBSS培地で解剖します。海馬を解剖はさみで細かく切り刻み、皿から15ミリリットルのチューブに移します。海馬を5ミリリットルのHBSSで2回洗浄し、洗浄後は4.5ミリリットルのHBSSに残します。

0.5ミリリットルの2.5%トリプシンを4.5ミリリットルのHBSSに加え、摂氏37度のウォーターバスで15分間インキュベートし、5分ごとにチューブを反転させます。よく消化された海馬は粘着性になり、クラスターを形成するはずです。必要に応じて、さらに5分間消化を延長します。

海馬をHBSSで3回、1回5分間洗浄します。洗浄後、2ミリリットルのHBSSを加え、パスツールピペットで海馬を上下に15回ピペットします。火で磨いたパスツールピペットで組織を10回粉砕し、すべての塊が底に着くまでチューブを5分間休ませます。残りのチャンクのほとんどが消えるまで、残りのチャンクで粉砕を繰り返します。

次に、1ミリリットルのピペットチップを使用して、解離したニューロンを含む上清をプレーティング皿に穏やかに移します。事前にインキュベートしたプレーティング培地に直接加え、プレートを軽く振ってください。種まき後2〜4時間で、光学顕微鏡でメッキ皿を確認します。ニューロンの大部分はカバーガラスに付着しているはずです。

先端の細い鉗子を使用して、ワックスドット側を下に向けて、事前に調整されたニューロン培養培地を含むグリア細胞フィーダー皿にカバーガラスを裏返します。ニューロンは、グリア細胞フィーダー皿で最大1か月間増殖できます。7日ごとにニューロンに1ミリリットルの新鮮なニューロン培養培地を与えます。