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トランスジェニックマウスの子犬の脳を取ります。
小脳を取り除き、脳を解剖します。蛍光タンパク質を発現する興奮性ニューロンを含む皮質海馬組織を分離します。
組織をバッファーを含む培養プレートに移します。
組織をみじん切りにし、パパインの入ったチューブに移します。
パパインは組織の細胞外マトリックスを消化し、ニューロンを含む細胞を緩めます。
消化された組織をBSAタンパク質の入ったチューブに移し、酵素活性を停止し、細胞の損傷を防ぎます。
組織を機械的に解離させ、細胞を放出します。
破片や酵素を含む上清を遠心分離して除去します。
細胞を低蛍光ニューロン培地に再懸濁し、細胞ストレーナーでろ過して細胞凝集体を除去します。
蛍光活性化細胞ソーティングを実行して、蛍光ニューロンを同定およびソートします。
選別されたニューロンを微量遠心チューブと遠心分離機に移します。ニューロンをニューロン培地に再懸濁します。
マルチウェルプレート内のポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラス上のシードニューロン。ニューロンはコーティングされた表面に付着します。
ニューロン培地を追加します。ニューロンの成長を促進するためにインキュベートします。
まず、小脳を解剖し、2つの半球を分離します。次に、海馬と皮質を各半球から慎重に分離します。解剖した組織を、冷やした細胞培養バッファーを含む35ミリメートルのペトリ皿に移します。
次に、解剖した海馬と皮質を別の35ミリメートルのペトリ皿の蓋に移します。メスの刃の平らな端を使用して、小さな破片だけが残るまで、組織を十字に慎重に切り刻
みます。次に、少量のパパイン溶液を含むみじん切り組織をペトリ皿の蓋から滅菌パパインチューブに移します。組織を摂氏37度で25分間インキュベートします。パパインインキュベーション後、滅菌パパインチューブと滅菌BSAチューブをフローキャビネットに移します。次に、1ミリリットルのパスツールピペットを使用して、皮質海馬組織のみをパパインチューブからBSAチューブ1に移します。
組織の大きな塊を砕くには、1ミリリットルのパスツールピペットを使用して組織を数回粉砕します。これに続いて、先端の細いパスツールピペットを使用して組織を7回粉砕します。30秒後、1ミリリットルの下部溶液と組織をBSAチューブ1からBSAチューブ2に移します。
先端の細いパスツールピペットを使用して、BSAチューブ2の組織を数回粉砕します。粉砕後、溶液中の下部組織1ミリリットルをBSAチューブ1からBSAチューブ3に移します。BSAチューブ3の組織を数回粉砕します。
粉砕後、チューブ2および3からすべての溶液と組織をBSAチューブ1に移します。さらに2〜3回粉砕し、3,000回gで3分間遠心分離します。遠心分離後、ペレット化組織から上清を慎重に除去し、P1000ピペットを使用して細胞を2ミリリットルの完全なHibernate A低蛍光培地に再懸濁します。次に、組織を20回粉砕して、組織溶液の完全な再懸濁を確実にします。
続いて、細胞懸濁液を30マイクロメートルのセルふるいを通してポリスチレンサンプルチューブにろ過します。300マイクロリットルの完全なHibernate A培地を必要な数のポリプロピレンチューブにピペッティングして、細胞選別収集チューブを準備します。
選別する蛍光細胞タイプごとに、適切な励起フィルターと発光フィルターを選択します。488ナノメートルの励起波長を使用して静脈タンパク質を励起し、40発光フィルターセットで530を介して放出された光を検出します。
531ナノメートルの励起波長を使用してTdTomatoタンパク質を励起し、30発光フィルターセットで575を介して放出された光を検出します。高純度にするには、明るく標識された蛍光細胞を選別します。細胞選別後、収集した細胞を2ミリリットルの丸底遠心分離管に移します。次に、細胞を3,000倍gで3分間遠心分離して、細胞ペレットを形成します。
細胞ペレットを必要な量の予熱した完全NBA培地に再懸濁して、マイクロリットルあたり1,000細胞の細胞密度を達成します。解離した細胞の存在を確認するには、4倍または10倍の対物レンズを使用して顕微鏡下で細胞溶液をチェックします。細胞をプレーティングする前に、中速で2〜3秒間ボルテックスして、細胞懸濁液が均一になるようにします。
ボルテックス後、10マイクロリットルの細胞懸濁液を各カバーガラスの中心にすばやくピペットで移します。1時間後、500マイクロリットルの予熱した完全NBA培地を細胞に供給し、摂氏37度のインキュベーターに戻します。