トランスジェニックマウスの子犬脳からの蛍光興奮性ニューロンの培養

トランスジェニックマウスの子犬の脳を取ります。

小

脳を取り除き、脳を解剖します。蛍光タンパク質を発現する興奮性ニューロンを含む皮質海馬組織を分離します。

組織をバッファーを含む培養プレートに移します。

組織をみじん切りにし、パパインの入ったチューブに移します。

パパインは組織の細胞外マトリックスを消化し、ニューロンを含む細胞を緩めます。

消化された組織をBSAタンパク質の入ったチューブに移し、酵素活性を停止し、細胞の損傷を防ぎます。

組織を機械的に解離させ、細胞を放出します。

破

片や酵素を含む上清を遠心分離して除去します。

細胞を低蛍光ニューロン培地に再懸濁し、細胞ストレーナーでろ過して細胞凝集体を除去します。

蛍光活性化細胞ソーティングを実行して、蛍光ニューロンを同定およびソートします。

選別されたニューロンを微量遠心チューブと遠心分離機に移します。ニューロンをニューロン培地に再懸濁します。

マルチウェルプレート内のポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラス上のシードニューロン。ニューロンはコーティングされた表面に付着します。

ニューロン培地を追加します。ニューロンの成長を促進するためにインキュベートします。

まず、小脳を解剖し、2つの半球を分離します。次に、海馬と皮質を各半球から慎重に分離します。解剖した組織を、冷やした細胞培養バッファーを含む35ミリメートルのペトリ皿に移します。

次に、解剖した海馬と皮質を別の35ミリメートルのペトリ皿の蓋に移します。メスの刃の平らな端を使用して、小さな破片だけが残るまで、組織を十字に慎重に切り刻

みます。

次に、少量のパパイン溶液を含むみじん切り組織をペトリ皿の蓋から滅菌パパインチューブに移します。組織を摂氏37度で25分間インキュベートします。パパインインキュベーション後、滅菌パパインチューブと滅菌BSAチューブをフローキャビネットに移します。次に、1ミリリットルのパスツールピペットを使用して、皮質海馬組織のみをパパインチューブからBSAチューブ1に移します。

組織の大きな塊を砕くには、1ミリリットルのパスツールピペットを使用して組織を数回粉砕します。これに続いて、先端の細いパスツールピペットを使用して組織を7回粉砕します。30秒後、1ミリリットルの下部溶液と組織をBSAチューブ1からBSAチューブ2に移します。

先端の細いパスツールピペットを使用して、BSAチューブ2の組織を数回粉砕します。粉砕後、溶液中の下部組織1ミリリットルをBSAチューブ1からBSAチューブ3に移します。BSAチューブ3の組織を数回粉砕します。

粉砕後、チューブ2および3からすべての溶液と組織をBSAチューブ1に移します。さらに2〜3回粉砕し、3,000回gで3分間遠心分離します。遠心分離後、ペレット化組織から上清を慎重に除去し、P10