0 閲覧数 • 2:41 分 • July 8th, 2025
マウス胚性幹細胞の培養から始めます。
細胞をバッファーで洗浄し、培地と細胞破片を除去します。
酵素カクテルを加えて、フラスコ表面から細胞を剥離します。
培地を加えて酵素活性を停止し、細胞をチューブに集めます。酵素を含む上清を遠心分離して廃棄します。
細胞を無血清ニューロン培養培地に再懸濁します。
ゼラチンでコーティングされたマルチウェルプレートウェルに細胞を播種します。
インキュベート。胚性幹細胞はゼラチンでコーティングされた表面に付着します。栄養素、成長因子、ホルモンなどの培地成分は細胞増殖を促進し、単層を形成します。
この細胞密度では、胚性幹細胞は最適なレベルの成長因子とサイトカインを産生および放出します。
これらの分子は細胞内シグナル伝達経路を引き起こし、胚性幹細胞の神経前駆細胞への分化
を促進します。ゼラチンを500ミリリットルの温かいPBSと混合し、細胞培養容器の底を表面をコーティングするのに十分な量の溶液で覆います。ゼラチンがコーティングされている間に、マウス胚性幹細胞のサブコンフルエント培養物をPBSで2回すすぎます。次に、1ミリリットルの解離試薬を培養物に加えます。
2〜5分後、容器を軽くたたいて単層を単一細胞懸濁液に除去し、培養物を合計10ミリリットルの培地と細胞解離試薬に回収します。
細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、遠心分離機で回転させます。次に、上清を注意深く吸引した後、気泡の発生を避けるために、ペレットを10ミリリットルの予熱したN2B27ピペッティングにチューブの側面に再懸濁します。
次に、濃度を記録した細胞をカウントし、表に従って予熱したN2B27でウェルあたりの単位体積あたりの適切な細胞数で再懸濁します。次に、培養容器からゼラチンを吸引し、容器を渦巻かずに細胞をプレーティングします。
培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%の湿ったインキュベーターに入れ、培地を1〜2日ごとに新鮮なN2B27と交換します。