JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 3:43 分 • July 8th, 2025
成長因子が豊富な増殖培地を含むマルチウェルプレートから始めます。
ゼブラフィッシュ神経幹細胞の単一細胞懸濁液を播種し、インキュベートします。
最初に、幹細胞は成長因子を利用して増殖します。
破片を除去し、新鮮な培地を加えて、継続的な細胞増殖と自発的な凝集を促進して、自由に浮遊する一次神経球を形成します。
次に、神経球を増殖培地を含む新鮮なウェルに移します。
同じ条件下でインキュベートして、神経球の漸進的な拡大を誘導します。
繰り返しピペットを打って、神経球を機械的に小さなクラスターに解離します。
次に、それらをよくコーティングされた細胞外マトリックスに移し、接着を促進します。
増殖培地をインスリンを含む成長因子フリー分化培地に交換します。
成長因子の欠如とインスリンの存在は、神経突起を伴うグリア細胞およびニューロンへの細胞分化を刺激します。
ニューロスフィア生成の準備をするには、24ウェルプレートの各ウェルに300マイクロリットルの新鮮なZ条件培地を充填します。次に、200マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに加え、マイクロリットルあたり約500細胞の密度で播種します。その後、プレートを摂氏30度で5%二酸化炭素でインキュベートします。
培養1日後、顕微鏡下で24ウェルプレート内の細胞を観察します。この段階で単一細胞懸濁液が観察されることを期待してください。ウェルの中央に破片が溜まっていることがわかった場合は、約100マイクロリットルの培地をピペッティングして除去し、100マイクロリットルの新鮮なZ条件培地を加えてこの液体を交換します。すべての破片が除去されたら、前述の条件下でプレートをインキュベートします。
さらに1日培養した後、250マイクロリットルの細胞懸濁液を単一のウェルから新しい空のウェルに移します。24 ウェルすべてに対してこの手順を繰り返します。次に、250マイクロリットルの新鮮なZ条件培地を各ウェルに加え、上下に穏やかにピペッティングして懸濁液を均質化します。同じ条件下でプレートを再度インキュベートし、さらに培養1日後にこの拡張手順を繰り返します。この期間の3日目と4日目に神経球のサイズが徐々に増加することが予想されます。
継代を開始するには、4日後に、各ウェルから250マイクロリットルの培地を除去しますが、神経球は除去しません。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、残りの培地容量の神経球を機械的に解離します。解離した各ウェルから細胞懸濁液をプールします。次に、血球計算器で細胞をカウントし、マイクロリットルあたり800細胞を含む250マイクロリットルの初代培養上清を新しい24ウェルプレートの各ウェルに分配します。続行して、250マイクロリットルのZ条件培地を各ウェルに加え、前述のようにプレートをインキュベートします。