人工多能性幹細胞由来脳オルガノイドの作製

人工多能性幹細胞(iPSC)のコロニーを支持マトリックス上で培養します。

酵素を含む溶液を加えて、コロニーを単一細胞に解離させます。

細胞をチューブに移し、遠心分離し、上清を廃棄します。

iPS細胞を増殖培地に再懸濁します。

細胞を生体適合性ポリマー繊維を含むマイクロプレートに移します。

心分離機でiPS細胞を強制凝集させ、胚様体(EB)をポリマー足場上

iPS細胞の増殖と神経幹細胞、前駆細胞、未熟ニューロンへの分化を促進する神経誘導培地への移行

インキュベーション時に、細胞は自己組織化を受けます。

胚様体をディンプルシートに置き、細胞外マトリックスタンパク質を含む滴を追加します。

キュベートしてマトリックスを固化させ、EBを埋め込みます。

EBを神経維持培地を含むマイクロプレートに移します。インキュベート。

EBは細胞増殖を経て突起や出芽を形成し、成熟したニューロンに分化して脳オルガノイドを形成します。

ピペットで培地を吸引し、DPBSで細胞を1回洗浄します。次に、500マイクロリットルの細胞剥離溶液、または0.5ミリモルのEDTAを加えてコロニーを解離させ、摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。次に、1ミリリットルの新鮮なE8培地を各ウェルに加え、ピペットで静かにピペットですべての細胞を切り離します。

細胞懸濁液全体を15ミリメートルの遠心分離管に移し、さらに1ミリリットルの新鮮なE8培地を加えます。次に、細胞を290gで室温で3分間スピンダウンします。

上清を廃棄した後、細胞ペレットを1ミリリットルのE6培地に再懸濁し、50マイクロモルのROCK阻害剤を添加し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。

ROCK阻害剤を添加したE6培地中で所望の座密度の細胞懸濁液を調製します。次に、150マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルの超低付着プレートの各ウェルに加えます。

次に、プレートを室温で290gで3分間遠心分離し、細胞を強制凝集させます。次に、胚様体形成のために、5%の二酸化炭素を含む加湿雰囲気でプレートを摂氏37度でインキュベートします。

24時間のインキュベーション後、プレートをフードに移し、ピペットチップをウェルに下ろしすぎて胚様体を吸引しないように注意しながら、ピペットを使用して120マイクロリットルの培地を慎重に吸引します。

次に、2マイクロモルのXAV939とSMAD阻害剤を添加した150マイクロリットルの新鮮なE6培地を各ウェルに加えます。プレートをインキュベーターに戻し、培地を毎日、阻害剤を添加した新しく調製されたE6と交換します。

インキュベーションの7日目に、すべての胚様体が直径550〜600マイクロメートルに達し、滑らかで明確なエッジを示しているかどうかを確認します。この段階で、それらは細胞外マトリックスに埋め込む準備ができています。

オルガノイドを埋め込むには、空のP200ボックスに長さ4インチの熱可塑性シーリングフィルムシートを置き、ディンプル包埋シートを準備します。次に、15ミリリットルの円錐形チューブまたは500マイクロリットルの微量遠心チューブを使用し、フィルムシートを穴にそっと押し下げて、12個、または必要な数のディンプルを作ります。

次に、フィルムシートに70%エタノールをスプレーし、UVライトをつけた状態でフード内で30分以上乾燥させます。その間、氷上で十分な量の基底膜マトリックスを解凍します。次に、ワイドボアP200チップを使用して、1つの胚様体を96ウェルプレートから各ディンプルに移します。通常のピペットチップでできるだけ多くの培地を取り除きますが、胚様体を乾燥させないでください。

次に、通常の事前に冷却されたP200チップを使用して、約30マイクロリットルの原液の膜マトリックスを各オルガノイドに加え、胚様体が液滴の中心にできるだけ近くなるようにします。

すべての胚様体がマトリックスに埋め込まれたら、フィルムシートを滅菌ペトリ皿に入れます。次に、ペトリ皿を摂氏37度で5%二酸化炭素を含む加湿雰囲気中で10分間インキュベートし、膜マトリックスを固化させます。

オルガノイド分化のために、ビタミンAを含まないB27を含む調製した分化培地5ミリリットルを、超低付着6ウェルプレートの1つのウェルに加えます。インキュベーターでプレートを摂氏37度に予熱します。メンブレンマトリックスが固まったら、フィルムシートの背面からディンプルを押し出して、埋め込まれた胚様体を6ウェルプレートに移します。必要に応じて、ウェルから1ミリリットルの培地を使用し、シートにピペットで取り、フィルムシートから液滴を剥がします。