ニューロン-グリア相互作用を研究するための間接ニューロン-アストロサイト共培養技術

ポリ-D-リジンでコーティングされた透過性メンブレンインサートを含むマルチウェルプレートから始めます。

アストロサイト増殖培地をウェルに加え、特殊なグリア細胞であるアストロサイトをインサートに播種します。

イン

キュベートして、静電相互作用を介してポリ-D-リジンに細胞が付着し、単層を形成します。

アストロサイト培地をニューロン培養培地に交換します。

このインサートを、ポリマーでコーティングされたカバーガラス上の接着した初代マウス胚性ニューロンを含むマルチウェルプレートに移します。

イン

キュベートして、2つの細胞型が物理的に分離されているが、同じ培地を共有する間接的なニューロン-星状細胞共培養を確立します。

アストロサイトは、ニューロンの生存と成長に不可欠なさまざまな神経栄養因子を分泌します。

これらの因子は透過性サポートを介して移動し、一次ニューロンと相互作用します。これにより、それらの分化が促進され、ニューロンの投影が形成されます。

これらの突起はニューロン間のシナプス接続を伸長させて確立し、ニューロンとグリアの相互作用を示します。

各インサートに1ミリリットルあたり10マイクログラムのポリ-D-リジンをコーティングし、1時間インキュベートします。1時間後、インサートをPBSで2回洗浄します。

そ

の間に、アストロサイト培地を吸引し、培養物を10ミリリットルのPBSで1回洗浄して、残留血清が確実に除去されるようにします。次に、3ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAをフラスコに加え、トリプシン処理のために細胞を約10分間インキュベートします。その後、細胞を7ミリリットルのアストロサイト培地に穏やかに再懸濁します。

細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、216倍gで5分間遠心分離します。次に、上清を注意深く吸引し、細胞ペレットを1ミリリットルのアストロサイト培地に再懸濁します。計数チャンバーを使用して細胞を計数します。続いて、ウェルあたり500マイクロリットルのアストロサイト培地を24ウェルプレートに充填します。PBSを吸引し、500マイクロリットルのアストロサイト培地中の25,000細胞を個々のインサートに移し、培養物を摂氏37度でインキュベートします。

海馬を解剖するには、調製培地で満たされた3つの10センチメートルの皿と、1ミリリットルの調製培地で満たされた1つの2ミリリットルのチューブを準備します。海馬を皮質部分から解剖し、調製培地で満たされた2ミリリットルのチューブに集めます。

海馬は、CNSの他の領域から隣接する組織なしで分離されることが重要です。したがって、海馬を除去した後、異物汚染組織を追加で除去する必要があります。

解剖後、チューブを滅菌層流ベンチに移します。調製培地を慎重に取り除き、パパインを含む消化液1ミリリットルで海馬組織を消化します。15分間消化した後、ピペットで穏やかに吸引して消化液を慎重に引き出します。

ニューロンの感度が高いため、気泡を避け、最適な粉砕強度を得るために、海馬を慎重に粉砕することが重要です。

洗浄サイクルごとに1ミリリットルの新鮮な培地を加えて慎重に吸引することにより、海馬をニューロン培地で3回洗浄します。最後の洗浄ステップの後、1ミリリットルのニューロン培地で組織を注意深く粉砕します。次に、計数チャンバーを使用して細胞を計数します。24ウェルプレートのウェルあたり500マイクロリットルのニューロン培地に35,000個の細胞をプレートし、ニューロンを摂氏37度で1時間インキュベートします。

次に、コンフルエント星状サイト単層で播種された準備されたインサートをインキュベーターから取り出します。アストロサイト培地を吸引し、500マイクロリットルの新鮮なニューロン培地と交換することにより、培地を交換します。

次に、無菌鉗子を使用して、アストロサイトを含むインサートをニューロン培養物を含むウェルに慎重に配置します。続いて、得られた間接ニューロンアストロサイト共培養を実験までインキュベーターに戻します。