成体マウス脳の皮質からのミクログリアの分離

採取したてのマウスの脳皮質を取ります。

組織を小さな断片に切り刻みます。それらを、RNase阻害剤とDNaseを含むバッファーを含む冷却ホモジナイザーに移します。

組織を最適に均質化して細胞を懸濁液に放出し、ニューロンや他のグリア細胞を除去しながら、せん断力に耐え、膜の生存率を維持する能力によりミクログリアを選択的に保存します。

さらに、RNase阻害剤はRNaseを分解し、DNaseは汚染されたDNAを分解します。

細胞懸濁液を細胞ストレーナーに通して組織破片を除去します。

細胞懸濁液をチューブに移します。酵素を含む上清を遠心分離して除去します。細胞をバッファーに再懸濁します。

抗ミエリン磁気マイクロビーズを追加します。これらのマイクロビーズはミエリンタンパク質を標的とし、ミエリン破片とオリゴデンドロサイトに結合します。

セルビーズ混合物を、強磁性球を持つマトリックスを含む枯渇カラムにロードします。

印加された磁場の下では、マイクロビーズに結合したミエリン破片とオリゴデンドロサイトがカラム内に保持され、ミクログリア細胞が通過します。

カラムをバッファーで洗浄し、ミクログリアを含むフロースルーを収集します。

まず、カミソリの刃を使用して、各脳領域を 1 立方ミリメートル未満の細かい部分に切り刻みます。先端を切り取った1ミリリットルのピペットを使用して、組織片を事前に冷却したDounceホモジナイザーに移します。目に見えるチャンクがなくなるまで、ピストンをDounceホモジナイザーにゆっくりとねじり込み、6〜10ストロークのフルストロークで組織を均質化します。次に、解離した組織を70マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに移します。

各Dounceホモジナイザーとピストンを合計6ミリリットルの冷媒体Aですすぎ、すすぎ液を遠心分離のために15ミリリットルのチューブに移します。単一細胞懸濁液を400倍g、摂氏4度で5分間遠心分離し、5で休憩します。

1 つの大きな枯渇カラムと 3 つの大きな選択カラムを 3 ミリリットルの MCS で磁気分離器ですすぎます。組織サンプルの遠心分離が完了したら、ペレットを乱すことなくピペットで取り出し、上清を廃棄します。RNase阻害剤を含むMCSバッファーに細胞を再懸濁します。

皮質および小脳からの再懸濁細胞を含む各チューブに100マイクロリットルのミエリン除去ビーズを加え、海馬および線条体からの再浮遊細胞を含む各チューブに50マイクロリットルのミエリン除去ビーズを追加します。チューブを氷上で10分間インキュベートします。

この後、皮質細胞を含むチューブにMCSを加えてその体積を最大2ミリリットルにし、残りのチューブに各体積を最大1ミリリットルにします。カラムからリンスバッファーが空になったら、2ミリリットルの皮質細胞をラージデプレゼントカラムにロードし、1ミリリットルの互いの細胞懸濁液を別々のラージセレクションカラムにロードします。次に、ラージデリプションカラムを1ミリリットルのMCSバッファーで1回洗浄し、各ラージセレクションカラムを1ミリリットルのMCSバッファーを使用して2回洗浄します。