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マウス皮質を細かく切り、緩衝塩溶液を含む冷解剖培地に移します。
消化酵素を加えて細胞外マトリックスを解離します。
残留酵素を除去するには、冷解培地で洗浄します。
この培地をアストロサイト濃縮培地に置き換えます。
次に、ピペットを使用して組織片を解離します。
懸濁液をストレーナーに通して解離していない組織を除去し、単一細胞を得る。
細胞を正に帯電したポリマーコーティングプレートに移します。振とうしながらインキュベートします。
星状細胞はしっかりと付着しますが、緩く結合したニューロン、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトは分離します。
濃縮培地は、成熟した星状細胞を分裂する多角形星状細胞に変換します。
剥離した細胞を取り除き、アストロサイトをリン酸緩衝液で洗浄します。
消化酵素を加えて星状細胞を剥離します。
酵素活性を止めるために血清を含む培地を加えます。アストロサイトをチューブに集めて遠心分離します。
上清を捨てます。細胞をアストロサイト成熟培地に再懸濁して、典型的な星形の成熟アストロサイト構造を促進します。
星状細胞の生成に使用する皮質組織を1立方ミリメートル以下の断片に切断します。すべての組織片が集められたら、それらがチューブの底に落ち着くのを待ちます。次に、できるだけ多くの培地を吸引します。その後、2〜3ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAを加え、サンプルを摂氏37度のウォーターバスで20分間インキュベートします。
その後、トリプシンEDTAを慎重に吸引し、チューブの底に最小限の液体に組織片を残します。次に、予冷した解剖培地5ミリリットルを加えて残りのトリプシンEDTAを洗い流し、上部チューブの側面にピペットで移動させて組織片の混合を実現します。次に、解剖培地を吸引し、組織片をできるだけ少ない液体に残します。
予冷した解剖培地でこの洗浄ステップを2回繰り返します。最終洗浄ステップの後、1ミリリットルの室温DMEM PLUSを加え、気泡を発生させずに上下にピペッティングして組織を滴定します。
アストロサイトはpHに非常に敏感であるため、溶液のpHが変化する可能性があるため、気泡の発生を避けることが重要です。
次に、100ミクロンのセルストレーナーを50ミリリットルのチューブの開口部に入れ、4.5ミリリットルの予冷DMEM PLUSでフィルターを予湿らせます。解離した組織懸濁液1ミリリットルを細胞ストレーナーにピペットで取り入れ、さらに4.5ミリリットルの予冷DMEM PLUSを加えて細胞を洗浄します。解剖後7 日目に、DMEM PLUSの細胞を含む10センチメートルの皿をインキュベーターのシェーカーに置き、皿を110 RPMで6時間振とうします。
6時間の振とうが終わる20〜30分前に、1X PBS、DMEM PLUS、NB+H、および0.25%トリプシンEDTAをウォーターバスで37度に予温します。6時間振とうした後、培養皿をシェーカーから取り出し、すぐに培地をディッシュあたり10ミリリットルの予熱した1X PBSと交換します。続いて、PBSを除去し、ディッシュごとに3ミリリットルの予熱トリプシンEDTAを加えます。
次に、サンプルを摂氏37度で4分間インキュベートします。次に、各皿に5ミリリットルの予熱したDMEM PLUSを3ミリリットルのトリプシンEDTAに加えます。細胞を皿からピペットで取り出し、細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに集めます。その後、細胞懸濁液を摂氏20度で3,220倍gで4分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、細胞ペレットを1ミリリットルの予熱したNB+Hに再懸濁します。