マクロファージ馴染培地を用いたニューロン伸長の促進

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さまざまな

細胞機能を調節するシグナル伝達分子である環状アデノシン一リン酸 (cAMP) から始めます。ニューロンとマクロファージの共培養にcAMPを追加します。

培地からのcAMP分子とニューロンからの成長因子は、マクロファージの活性化を引き起こします。

活性化されたマクロファージを含むインサートを、マクロファージ培養培地を含む別のウェルに移します。

ここで、マクロファージはサイトカインとケモカインを培地に放出し、条件付け培地またはCMを形成します。

CMを遠心分離して、細胞成分をペレット化します。

上清とフィルターを移して細胞破片を除去します。

収集したCMをニューロン培養に追加します。収集されたCMのサイトカインとケモカインは、ニューロンの伸長を促進します。

冷やしたパラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定します。

抗体の非特異的結合を避けるためにブロッキングバッファーを追加します。洗浄して残留バッファーを除去します。

ニューロンの細胞骨格タンパク質を標的とする一次抗体を適用します。結合していない抗体を洗浄して除去します。

一次抗体に結合する赤色蛍光色素結合二次抗体を追加します。結合していない抗体を洗浄して除去します。

蛍光顕微鏡を使用して、赤色のニューロンを拡張して視覚化します。

ニューロンマクロファージを共培養してから4時間後、2マイクロリットルの100マイクロモルdb-cAMP溶液をニューロンマクロファージ共培養物に加えます。24時間後、同じ6ウェルプレートに1ミリリットルのマクロファージ培地を空のウェルに充填します。

ニューロンマクロファージ共培養中の細胞培養インサートを、マクロファージ培養培地を含む空のウェルに移します。72時間後、マクロファージ調整培地を239 gで5分間遠心分離して、細胞成分を除去します。上清を0.2マイクロメートルのフィルターに通し、残っている細胞破片を除去します。

この手順では、8ウェルチャンバースライドをポリD-リジンとラミニンでプレコートします。次に、B 27を添加した神経基底培地中で関連する成体DRGニューロンを取得します。ウェルあたり5 x 104細胞をプレコートされた8ウェルチャンバースライドにプレートします。

次に、チャンバースライドを摂氏37度のインキュベーターに2時間入れ、細胞を底に付着させます。次に、培地を摂氏37度に予熱した解凍したコンディショニング培地と交換します。最初のプレーティングの15時間後、培地を取り出し、PBSで細胞を1回洗浄します。

次に、200マイクロリットルの氷冷4%パラホルムアルデヒド溶液をウェルに加え、細胞をパラホルムアルデヒド溶液とともに摂氏4度で20分間インキュベートします。続いて、固定細胞を一次抗体溶液とインキュベートし、10%正常なヤギ血清で希釈して室温で4時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。その後、蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影し、神経突起の成長を視覚化します。

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最終更新:1 8月 2026