マイクロ流体デバイスを用いた運動ニューロンにおけるオルガネラの軸索輸送の追跡

複数のマイクロ溝を介して接続された近位ウェルと遠位ウェルを備えたポリマーコーティングされたマイクロ流体チャンバーから始めます。

近位ウェルに、発達中の運動ニューロンが豊富なマウス胚性脊髄組織を配置します。

これを栄養培地で十分に補います。ニューロンの成長とポリマーコーティングされた表面への付着を可能にするためにインキュベートします。

その後、成長因子を含まない栄養培地を近位ウェルに加えます。

遠位ウェルでは、成長因子を含む栄養培地を大量に添加して、濃度と体積の違いを作成します。

これらの違いにより、より長いニューロン突起である軸索が、マイクログルーブを介して遠位ウェルに向かって成長します。

両方のウェルに蛍光色素溶液を加えます。

色素分子はニューロンに入り、ミトコンドリアと両端の酸性細胞小器官を染色します。

ライブ共焦点イメージングでは、蛍光染色された細胞小器官が神経細胞体と軸索の間で両方向に移動し、運動ニューロンにおける軸索輸送を確認します。

MFCの近位コンパートメントからすべての培地を廃棄します。総容量4マイクロリットルのピペットで単一の脊髄外植片をピックアップし、洞窟のできるだけ近くに注入します。側面の出口を介して近位ウェルから余分な液体を引き出します。前の手順をさらに2回繰り返し、外植片が近位チャネルに埋め込まれていることを確認します。ゆっくりと、150マイクロリットルのSCEX培地を近位ウェルに加えます。

プレーティングの1日後、近位コンパートメントのSCEX培地を交換し、遠位コンパートメントに豊富なSCEX培地を追加し、遠位ウェルと近位ウェルの間でウェルあたり少なくとも15マイクロリットルの体積勾配を維持します。4〜6日後、軸索は遠位コンパートメントに交差し、軸索輸送イメージングの準備が整うはずです。

ミトコンドリアと酸性コンパートメントを標識するには、100ナノモルのMitotracker深赤FMと100ナノモルのLysoTracker赤で新鮮なSCEX培地を調製し、マイクロ流体チャンバーに加えます。それらを摂氏37度で30〜60分間インキュベートし、温かいSCEX培地で3回洗浄します。軸索輸送のライブイメージングを進め、100秒間隔で100タイムラプス画像シリーズを取得し、1つのムービーあたり合計5分を取得します。