ラット膀胱からの初代ニューロンとグリアの分離と培養

安楽死させられたネズミを例に挙げます。

腹部を開き、膀胱を切除し、緩衝液に浸します。

膀胱を切り開き、付着した脂肪や組織の破片を取り除きます。

膀胱を緩衝液の入ったチューブに移し、遠心分離し、破片を取り除きます。

組織

をコラゲナーゼを含む溶液に入れ、みじん切りにします。コラゲナーゼをさらに添加して細胞外マトリックスを分解し、細胞を緩めます。

遠心分離して上清を廃棄します。トリプシンを加えて細胞間結合を破壊し、細胞を放出します。

タンパク質を含むリンス培地を加えてトリプシンを不活性化し、遠心分離して上清を除去します。

細胞を培地に再懸濁し、ろ過して凝集体を除去し、単一細胞懸濁液を得る。

遠

心分離して上清を除去します。細胞を培地に再懸濁します。

コーティングされたカバーガラスに細胞をプレートして、ニューロンとグリア細胞の付着を促進します。付着していないセルを取り外します。

成長因子を含むニューロン培地を添加して細胞の成熟を促進し、初代ニューロンおよびグリア培養を確立します。

まず、

滅菌した手術用タオルの上にラットを置き、腹部を露出させます。はさみと鉗子を使用して腹腔を開き、膀胱を露出させます。別のセットのはさみと鉗子を使用して膀胱をそっと持ち上げ、膀胱の首から切り取ります。

次に、膀胱を冷たく酸素安定性のあるクレブス溶液にすばやく入れて、細胞の生存率を改善します。クレブス溶液を3つのガラス皿と3つのガラスビーカーに加え、氷浴に入れて予冷します。混乱を防ぐために、皿とビーカーに1、2、3の番号を付けます。

ガラス皿1で、眼科用ハサミで膀胱を開き、鉗子とスプーン核仕切りで広げます。ガラスビーカー1でブラダーをすすぎ、ガラス皿2に入れます。鉗子と眼科用ハサミを使用して、組織表面の付着脂肪を取り除きます。次に、ビーカー2で膀胱をすすぎ、皿3に入れます。

鉗子とスプーンの核仕切りを使用して膀胱をそっとこすり、外因性付着物を取り除きます。ガラスビーカー3でブラダーをすすぎ、14ミリリットルの冷たいクレブス溶液を入れた15ミリリットルの遠心分離管に移します。サンプルを360倍g、摂氏4度で1分間遠心分離します。

ブラダーを遠心分離管から1ミリリットルの消化液を含む2ミリリットルのバイアルに移します。眼科用ハサミを使用して膀胱を細かく切ります。無菌細胞培養皿で膀胱溶液を9ミリリットルの消化液1と混合します。最初の消化を振とうインキュベーターで摂氏37度、200RPMで5%の二酸化炭素で1時間行います。最初の消化後、溶液を300倍g、摂氏4度で8分間遠心分離します。

その

間、消化液2を摂氏37度の水浴に入れて予熱します。遠心分離後、消化液1を含む上清の大部分を除去し、細胞の損失を避けるために上清を一部残します。

細胞を温かい消化液2に再懸濁し、摂氏37度の水浴で5分間消化しながら混合物を振とう。消化が完了したら、10ミリリットルのコールドリンス培地を加えて、すぐにトリプシンを不活性化します。細胞を360倍g、摂氏4度で8分間遠心分離します。次に、できるだけ多くの上清を除去して、すべてのトリプシンを除去します。

溶液中に気泡が発生しないように、3ミリリットルのニューロン培地で沈殿物を穏やかに再懸濁します。懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルの遠心分離管にろ過します。360回g、摂氏4度で8分間遠心分離して細胞を採取します。次に、細胞ペレットを1ミリリットルのニューロン培地Aに穏やかに再懸濁し、500マイクロリットルの細胞懸濁液を48ウェルプレートの各ウェルに加えます。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で培養します。