プラスチックマイクロ流体チップを用いた分別初代マウスニューロン培養

細胞リザーバーとコンパートメント、および軸索リザーバーとコンパートメントで構成され、マイクログルーブで接続されたプラスチック製のマイクロ流体チップを取ります。

プレコーティング溶液を追加してコンパートメントと溝を飽和させ、気泡の閉じ込めを防ぎます。

溶液を吸引し、メインコンパートメントを満たしたままにします。バッファーで洗浄します。

ニューロンの接着を促進する合成ポリマーでウェルをコーティングします。バッファーで洗浄し、チップが乾燥しないように培地を加えます。

ラット海馬ニューロンの懸濁液を播種するには、培地を吸引します。

懸濁液を体細胞リザーバーにロードします。ニューロンは体細胞コンパートメントに入り、付着します。

ニューロン培養培地をウェルに加え、インキュベートします。培地中に存在する成長因子は、ニューロンの成長を促進します。

徐々に、ニューロンは軸索を伸ばし、微小溝を通って軸索コンパートメントに成長します。

溝が狭いため、神経細胞体の侵入が妨げられ、体細胞領域と軸索領域の物理的分離が保証されます。

まず、滅菌済みのマルチコンパートメントチップをペトリ皿に入れます。チップの左上のウェルに100マイクロリットルのプレコーティング溶液を加え、メインチャネルを通って隣接するウェルに流れるようにします。次に、チップの左下ウェルに100マイクロリットルのプレコーティング溶液を入れます。

今度は、溶液がマイクログルーブを通るまで5分間待ちます。次に、100マイクロリットルのプレコーティング溶液を右上のウェルに加え、メインチャネルを通って隣接するウェルに流れ込みます。90秒後、右下のウェルに100マイクロリットルのプレコーティング溶液を入れ、チップを10分間インキュベートします。

ピペットチップをメインチャネルから慎重に離し、各ウェルから溶液を吸引します。次に、すぐに150マイクロリットルのPBSを左上のウェルに加え、1.5分待ちます。次に、150マイクロリットルのPBSを左下ウェルに加え、液体がマイクロ溝を通って流れるように5分間待ちます。

次に、150マイクロリットルのPBSを右上と右下のウェルに順番に加えます。10分後、再びPBSを吸引し、洗浄ステップをもう一度繰り返します。2回目の洗浄に続いて、ピペットチップをチャネル開口部から離して角度を付けて、前と同じようにPBSをウェルを吸引します。

次に、100マイクロリットルの0.5mg/mlのポリ-D-リジン溶液をチップの左上のウェルに加えます。1分半待ってから、左下のウェルに100マイクロリットルのポリ-D-リジン溶液を入れます。チップの右半分でこのプロセスを繰り返します。ペトリ皿を閉じ、チップを摂氏37度のインキュベーターに1時間入れます。

インキュベーション後、前述のようにチップをPBSで2回すすぎます。次に、デバイスからPBSを吸引します。すぐに、100マイクロリットルの細胞培養培地をチップの左上のウェルに加えます。1分半後、左下に培地をウェルに加えます。

メディアがマイクロ溝を通るまで 5 分間待ってから、チップの右側で充填プロセスを繰り返します。確立されたプロトコルに従って、解離したラット海馬ニューロンの細胞懸濁液を調製します。チップの各ウェルにある培地の大部分を除去しますが、チャネルは満たしたままにします。

次に、すぐに5マイクロリットルの細胞懸濁液を右上のウェルにロードし、さらに5マイクロリットルの細胞懸濁液を右下のウェルにロードします。セルをロードするときは、ピペットの先端をメインチャネルに向けます。細胞をロードした後、チップを顕微鏡ステージに移して、ニューロンがメインチャネルにあることを確認します。

細胞が付着するまで5分間待った後、約150マイクロリットルのニューロン培養培地を右上ウェルと右下ウェルのそれぞれに加えます。次に、左上ウェルと左下ウェルのそれぞれに150マイクロリットルの培地を追加します。ペトリ皿に蓋をし、チップを摂氏5%二酸化炭素37度のインキュベーター内の加湿トレイに入れます。