ゼブラフィッシュ胚からの初代網膜神経節細胞培養物の作製

胚培地中の初期発生段階のゼブラフィッシュ胚から始めます。

胚を取り囲む保護膜である絨毛膜を取り除き、胚を培地を含む新鮮な培養プレートに移します。

胚の尾部を取り除き、頭を分離し、目を頭からそっと切り離します。

目には網膜神経節細胞を収容する組織の薄い層である網膜が含まれています。

ゼブラフィッシュ細胞培地の入ったチューブに目を移します。

目を機械的に解離して網膜神経節細胞を放出し、単一細胞懸濁液を形成します。

ゼブラフィッシュ培養培地の入った培養プレートに入れたカバーガラスを取ります。

カバーガラスは合成ポリマーと接着タンパク質でコーティングされています。

細胞をカバーガラスの中心に移し、インキュベートします。

網膜神経節細胞はコーティングされた表面に付着し、さらに、これらの細胞は軸索と呼ばれる長い突起を発達させます。

インキュベーターからゼブラフィッシュ胚を取り出し、70%エタノールを含む35ミリメートルの組織培養皿に胚を5〜10秒間浸漬して滅菌します。トランスファーピペットを使用して、胚を滅菌E2培地を含むE2培地#1皿に移し、余分なエタノールを洗い流します。次に、胚をE2 Media #2皿に移し、鋭利な鉗子で絨毛膜を取り除きます。最後に、胚をE2培地#3皿に移して解剖を行います。

一対の細い鉗子を使用して、鉗子の1つで胚を卵黄の前方に配置して保持し、他の鉗子で卵黄嚢の後ろの尾を取り除きます。鉗子で首をつかみ、頭を外して脳と目をE2メディアにさらします。細い鉗子の先端で、2番目の鉗子で頭蓋組織を押さえながら、頭から目をそっと転がします。ZFCM+を含む事前に準備されたチューブの1つに4つの目を移します。

P20ピペットで上下に約45回穏やかに粉砕し、細胞を解離させます。解離した細胞を含むZFCM+をカバーガラスの中心に移します。振動を吸収するために、ベンチトップの上、発泡スチロールのラックの上に培養物を摂氏22度に維持します。イメージング当日、顕微鏡で細胞をチェックし、RGC軸索の成長を検証します。