JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 3:50 分 • July 8th, 2025
スライス溶液に浸した人間の脳組織を取ります。溶液の生物学的pHと栄養素は、組織の機能を維持するのに役立ちます。
最も外側の髄膜層を取り除き、組織をトリミングして平らな表面を作成します。
組織から余分な溶液を吸い取ります。トリミングした組織をアガロースブロックで検体ディスクに取り付け、切片化を容易にするために組織をブロックに接触させたままにします。
ディスクをビブラトームバッファートレイに入れ、氷冷のスライス溶液で組織を覆います。
ビブラトームを使用して、組織構造を維持する均一なスライスを生成します。
余分な組織を切り取り、灰白質と白質の割合を一定に保ちます。
スライスを培地を含むマルチウェルプレートに入れ、インキュベートします。
スライスは培地中に懸濁したままになり、栄養素の均一なアクセスを確保するため、フリーフローティングスライス培養として知られる技術です。
組織の生存率を維持するために、神経成長因子を補充した培地を培養物に定期的に補充します。
試料をスライス溶液の入ったペトリ皿に移します。細かい手術器具を使用して、残りの髄膜をできるだけ慎重に取り除きます。実験計画の特定の特性を持つスライスを製造するための最適な標本の向きを選択し、24番のメスの刃を使用して、標本ディスクに接着するベースとなる平らな面をトリミングします。
使い捨てのプラスチックスプーンとデリケートな絵筆を使用して、ペトリ皿から破片を集め、濾紙で余分な溶液を乾かします。次に、瞬間接着剤を使用して、組織が皿にしっかりと付着し、アガロースブロックと接触するまで、組織をビブラトーム標本皿に貼り付けます。
ビブラトーム検体ディスクをビブラトームバッファートレイに入れます。カミソリの刃をしっかりと固定した状態で、ナイフホルダーを所定の位置にロックします。スライス溶液を加え、標本とブレードの両方を覆っていることを確認します。次に、検体を 200 マイクロメートルのスライスにスライスし始めます。
スライスをバッファートレイからスライス溶液の入ったペトリ皿に移し、緩んだエッジと余分な白質を皮質約70%、白質30%の割合にトリミングします。層流キャビネットで、24ウェルプレートの各ウェルに600マイクロリットルの培地を加え、スライスをプレーティングする前に、摂氏36度で5%二酸化炭素とともに少なくとも20分間インキュベートします。この後、絵筆を使用して、各ウェルに1つのスライスをプレートします。
プレートに未使用の井戸がある場合は、400マイクロリットルの滅菌水で満たします。摂氏36度で5%の二酸化炭素でインキュベートします。以前に調製した培地10ミリリットルに、1ミリリットルあたり50ナノグラムの濃度の脳由来神経栄養因子を補充します。
8〜16時間後、各ウェルから333マイクロリットルのコンディショニング培地を取り出し、133マイクロリットルの新鮮なBDNF添加培地を加えます。コンディショニング培地の3分の1を24時間ごとに新鮮なBDNF補給培地と交換します。