無血清培地を用いたラット脳からのミクログリアの単離と培養

灌流されたラットの脳を取ります。それを小さな断片に刻

みます。

バッファーで組織を均質化して、ミクログリアを含む細胞を放出します。

未消化の組織が落ち着いたら、細胞を含む上清を回収し、ミエリン分離バッファーを加えます。

内容物を混合し、遠心分離して細胞をミエリンや破片から分離します。ミエリン破片層と上清を取り除きます。

細胞をバッファーに再懸濁し、ピペットで塊を分離します。

懸濁液をストレーナーに通して、残りの細胞凝集体を除去します。

ろ過した細胞をミクログリア特異的モノクローナル抗体でコーティングされた培養プレートに移します。ミクログリアの接着を促進するためにインキュベートします。

緩衝液で洗浄して、非接着細胞を除去します。トリプシンを加え、インキュベートしてミクログリアを緩めます。

トリプシンを取り除きます。

無血清培地を追加します。氷上でインキュベートして、細胞と基質の相互作用を弱めます。

ピペットを打って、懸濁液をチューブに集めます。遠心分離して上清を除去します。

ミクログリアを無血清培地に再懸濁し、コラーゲンでコーティングされたマルチウェルプレートに移します。ミクログリアの接着を促進するためにインキュベートします。

成長因子と脂質を含む培地を追加します。ミクログリアの成熟のためにインキュベートします。

脳を冷たいDPBSで集めた後、各脳を氷上のシャーレで冷たいメスの刃で1立方ミリメートルの塊に切り刻み、5〜7ミリリットルの氷冷ダウンシングバッファーを含む氷冷ダウンスホモジナイザーに移します。次に、ゆったりとしたDounceホモジナイザーを使用して、10〜20回の穏やかで不完全なストロークで組織を解離します。ホモジナイザーの底にある組織を直接押しつぶさないように注意してください。代わりに、ピストンとホモジナイザーの側面の間の空間を通して組織を推進します。

ミクログリアの生存率を維持するには、複数回のダウンシングで組織をゆっくりと均質化することが重要です。

その後、気泡の侵入を防ぐためにピストンを慎重に取り外します。解離が不十分な組織の塊をホモジナイザーの底に沈殿させ、上清を新しい冷却した50ミリリットルの円錐形チューブに移します。続いて、除去したボリュームを新しいダウンシングバッファーと交換し、合計3〜4ラウンド、またはすべての組織が解離するまで解離手順を繰り返します。

この手順では、細胞懸濁液を含む50ミリリットルのコニカルチューブに氷冷のダウンシングバッファーを加え、総量を33.5ミリリットルに調整します。次に、細胞懸濁液に10ミリリットルのMSBを加え、チューブを数回反転させて十分に混合します。これにより、43.5 ミリリットルの体積で MSB の最終濃度が 23% になります。

その後、細胞を摂氏4度で500gで15分間遠心分離し、ゆっくりとブ