無血清培地を用いたラット脳からのミクログリアの単離と培養

灌流されたラットの脳を取ります。それを小さな断片に刻

バッファーで組織を均質化して、ミクログリアを含む細胞を放出します。

未消化の組織が落ち着いたら、細胞を含む上清を回収し、ミエリン分離バッファーを加えます。

内容物を混合し、遠心分離して細胞をミエリンや破片から分離します。ミエリン破片層と上清を取り除きます。

細胞をバッファーに再懸濁し、ピペットで塊を分離します。

懸濁液をストレーナーに通して、残りの細胞凝集体を除去します。

ろ過した細胞をミクログリア特異的モノクローナル抗体でコーティングされた培養プレートに移します。ミクログリアの接着を促進するためにインキュベートします。

緩衝液で洗浄して、非接着細胞を除去します。トリプシンを加え、インキュベートしてミクログリアを緩めます。

トリプシンを取り除きます。

無血清培地を追加します。氷上でインキュベートして、細胞と基質の相互作用を弱めます。

ピペットを打って、懸濁液をチューブに集めます。遠心分離して上清を除去します。

ミクログリアを無血清培地に再懸濁し、コラーゲンでコーティングされたマルチウェルプレートに移します。ミクログリアの接着を促進するためにインキュベートします。

成長因子と脂質を含む培地を追加します。ミクログリアの成熟のためにインキュベートします。

脳を冷たいDPBSで集めた後、各脳を氷上のシャーレで冷たいメスの刃で1立方ミリメートルの塊に切り刻み、5〜7ミリリットルの氷冷ダウンシングバッファーを含む氷冷ダウンスホモジナイザーに移します。次に、ゆったりとしたDounceホモジナイザーを使用して、10〜20回の穏やかで不完全なストロークで組織を解離します。ホモジナイザーの底にある組織を直接押しつぶさないように注意してください。代わりに、ピストンとホモジナイザーの側面の間の空間を通して組織を推進します。

ミクログリアの生存率を維持するには、複数回のダウンシングで組織をゆっくりと均質化することが重要です。

その後、気泡の侵入を防ぐためにピストンを慎重に取り外します。解離が不十分な組織の塊をホモジナイザーの底に沈殿させ、上清を新しい冷却した50ミリリットルの円錐形チューブに移します。続いて、除去したボリュームを新しいダウンシングバッファーと交換し、合計3〜4ラウンド、またはすべての組織が解離するまで解離手順を繰り返します。

この手順では、細胞懸濁液を含む50ミリリットルのコニカルチューブに氷冷のダウンシングバッファーを加え、総量を33.5ミリリットルに調整します。次に、細胞懸濁液に10ミリリットルのMSBを加え、チューブを数回反転させて十分に混合します。これにより、43.5 ミリリットルの体積で MSB の最終濃度が 23% になります。

その後、細胞を摂氏4度で500gで15分間遠心分離し、ゆっくりとブレーキをかけます。次に、ミエリンの最上層、破片、および上清をピペットで除去します。最上層を取り外すときは、できるだけ多くの層が取り除かれるように注意してください。

その後、細胞ペレットを12ミリリットルのパンニングバッファーに再懸濁します。細胞懸濁液を穏やかに粉砕して、残っている細胞の塊を分解します。このステップでは、細胞懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーに通して、大きな破片や細胞の塊を除去します。OX42コーティングされたパンニング皿をDPBSで3回すすいでください。洗濯の合間にプレートが完全に乾かないようにしてください。

最後のDPBS洗浄液を注ぎ、ろ過した細胞懸濁液をパン皿に塗布します。プレートをそっと回転させて細胞を分散させます。次に、プレートを室温の平らな面で20分間インキュベートし、細胞が接着できるようにします。20分以上インキュベートしないと、細胞が皿から回復するのが非常に困難になります。その後、パンニング皿をDPBSで10回すすぎ、非接着細胞を除去します。

ミクログリアはプレートにしっかりと付着するため、すすぎのたびにプレートを回転させて、他の非接着細胞を確実に除去します。最後のDPBS洗浄液を注ぎ、15ミリリットルのDPBSと200マイクロリットルのトリプシンと交換します。

細胞をトリプシン化するには、ディッシュを摂氏37度で10分以下インキュベートします。トリプシン処理を10分間行った後も、ミクログリアはプレートに付着したままです。混合物を注ぎ、プレートをDPBSで2回穏やかに洗浄してトリプシンを除去します。次に、12ミリリットルの氷のように冷えたMGMと交換します。

その後、パンニング皿を氷の上に2分間置き、細胞と基質の相互作用を弱め、皿が平らであることを確認して、パン皿の領域が乾燥しないようにします。その後、10ミリリットルのピペットとピペットコントローラーで高速で激しくピペットし、パニング皿から細胞を回収します。ピペットからの液体の流れで16×16のグリッドを描き、すべての細胞を取り除こうとします。

細胞全体の回復と培養物の健全性の間のバランスを見つけることが重要です。パニングディッシュに対して細胞上清をピペッティングを繰り返すと、培養の生存率が低下します。

細胞を20倍の倍率で顕微鏡でチェックし、プレートから剥がれていることを確認します。細胞が詰まっている皿の上のスポットに印を付け、それらの領域でピペッティングを繰り返します。細胞懸濁液を回収し、各15ミリリットルの円錐形チューブに3〜4ミリリットルの上清を分注します。摂氏4度で500gで15分間回転させ、ゆっくりとブレーキをかけます。

15分後、上清を吸引し、細胞ペレットに0.5ミリリットルのMGMを残します。次に、各ペレットを残りのMGMに再浮遊させ、すべてのチューブから細胞をプールします。その後、血球計算器で細胞を数えます。

次に、15マイクロリットルのコラーゲンIVコーティングを24ウェル陰イオン性カチオン性コーティング組織培養プレートの中心に直接プレートし、摂氏37度で15分間インキュベートします。血球計算盤で細胞を数えた後、MGMで1ミリリットルあたり2.3 x 10^〜5に希釈します。コラーゲンIVスポットを吸引し、すぐに15マイクロリットルの細胞懸濁液をこのスポットにプレートして、スポットあたり3.5 x 10³細胞を生成します。

次に、摂氏37度で5〜10分間インキュベートして、細胞を接着させます。次に、500マイクロリットルのCO₂平衡化TICをウェルにそっと加えます。