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した脳から始めましょう。事前に冷却された人工脳脊髄液または aCSF に脳をすばやく沈めて、代謝プロセスを一時停止します。
aCSF には、神経細胞の損傷と死を軽減する大きな有機陽イオンである NMDG が含まれています。
aCSF には HEPES も含まれており、pH と塩分濃度を維持し、細胞の腫れや損傷を防ぎます。
脳をろ紙の入ったペトリ皿に移します。
脳をトリミングして目的の領域を取得します。
適切な接着剤を使用してブレインブロックを検体ホルダーに固定し、アガロースに埋め込みます。
試料ホルダーをスライサーに配置します。
スライサーのリザーバーに事前に冷却された aCSF を満たし、溶液を通気して最適な酸素供給を確保します。
脳ブロックの断面を入手します。
切片を予熱したaCSFに移して代謝プロセスを再開し、切片を回復させます。
無傷の脳を予冷したNMDG-HEPES aCSFのビーカーにそっとすくい取り、脳を約1分間均一に冷却します。次に、大きなへらを使用して、脳をビーカーからろ紙で覆ったペトリ皿に移します。
スライスの好みの角度と目的の脳の関心領域に従って、脳をトリミングして取り付けます。取り扱い中の長時間の酸素欠乏を避けるために迅速に作業してください。その後、接着剤を使用してブレインブロックを検体ホルダーに貼り付けます。
検体ホルダーの内側部分を引っ込めて、ブレインブロックを完全に内側に引き込みます。次に、脳ブロックがアガロースで完全に覆われるまで、溶融アガロースをホルダーに直接注ぎます。続いて、アガロースが固まるまで、予冷したアクセサリ冷却ブロックを試料ホルダーの周りに10秒間クランプします。
試料ホルダーをスライサーマシンのレセプタクルに挿入し、正しい位置合わせを確認します。その後、250ミリリットルのビーカーから残りの予冷され、酸素化されたNMDG-HEPES aCSFをリザーバーに充填し、適切な酸素供給を確保するためにスライス中、バブルストーンをリザーバーに入れます。
次に、マイクロメーターを調整して、アガロース包埋脳標本の前進を開始します。スライサーを起動し、高度な速度と発振周波数を希望のレベルに経験的に調整します。関心のある脳領域が完全に切片化されるまで、300マイクロメートル刻みで組織を前進させ、スライスし続けます。スライス手順の合計時間は15分未満でなければなりません。
最初のNMDG回収では、切片手順の完了時に、切断されたプラスチック製パスツールピペットを使用してすべてのスライスを収集し、150ミリリットルのNMDG-HEPES aCSFで満たされた摂氏34度の回収チャンバーに移します。
急性脳スライス回復ステップのタイミングは、形態学的保存と各ニューロンの電気生理学的特性の機能回復とのバランスをとるために非常に重要です。