JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 3:30 分 • July 8th, 2025
無傷のマウスの目を人工脳脊髄液(aCSF)に取り、網膜を含むアイカップを切開して分離します。
酵素溶液で処理して内側の境界膜を取り除き、神経細胞を露出させます。
組織を阻害溶液に浸して消化を止め、洗浄して余分な溶液を取り除きます。
組織を低温の特殊なインキュベーターに入れて、細胞の代謝を遅らせ、組織を保存します。
このインキュベーターは、組織を取り付けるためのメッシュを備えたメインチャンバーで構成されています。チャンバーは aCSF で満たされ、その温度と pH は組織の機能を維持するために制御されています。
微生物汚染を排除するために、aCSF は別のチャンバーにポンプで送られ、紫外線で処理されて微生物を殺します。
滅菌されたaCSFは、メインチャンバーにポンプで戻されます。
網膜を分離するには、アイカップを取り外し、網膜を周囲の組織から分離して、インキュベーターに戻します。
網膜全体のマウントの準備のために、安楽死させた動物からすぐに目を摘出します。鋸歯部に沿って小さな切り込みを入れ、室温でカルボゲンを供給するエイムズメディアまたはaCSFのいずれかに目を置きます。その後、すぐに角膜、水晶体、硝子体を小さなハサミで鋸歯に沿って切り取り、鉗子で取り除きます。組織を室温のインキュベーションシステムに入れます。
内側の境界膜を取り除くには、網膜を含むアイカップを、パパイン、L-システイン、EDTA、およびDNAseが入った小さなガラス瓶に摂氏37度で20分間移します。蓋を通して溶液にカルボゲンを塗布しますが、泡立たないでください。組織をオボムコイドとBSA溶液にアールのBSSで10分間入れて、酵素消化を停止します。次に、組織をaCSFで完全に洗浄します。
続いて、組織をインキュベーションシステムに移し、温度を摂氏約15〜16度に下げます。その後、網膜組織を顕微鏡に移します。網膜をアイカップから分離し、カミソリの刃で4つに切ります。網膜全体が必要な場合は、網膜の周囲に 4 つの小さな切り込みを入れて、網膜を平らにします。
この組織は、電気生理学のために顕微鏡に移したり、ブレインキュベーターで維持したりできるようになりました。組織は、pHおよび温度測定用のプローブを含むメインチャンバーに維持されます。2番目のチャンバーはメインチャンバーから隔離されており、溶液中に浮遊するバクテリアを照射するために1.1ワットのUVC光にさらされます。蠕動ポンプを使用して 2 つのチャンバー内で aCSF を循環させ、ペルチェ熱電コールド プレートを使用してメイン チャンバーを冷却または加熱します。