マウスの脳梁下ゾーンからの成体神経幹細胞の単離と培養

冷却

された脳マトリックス上のマウスの脳から始めます。

脳梁下ゾーンまたはSCZを含む切片を取得します。切片を冷リン酸緩衝液に移します。

解剖

顕微鏡下で、SCZ部分を切り取ります。

解剖

したSCZを細かく切り刻

みます。

これらの断片を消化バッファーに移します。インキュベートして細胞を組織から解離させます。

遠心分離して上清を廃棄します。細胞を適切な培地に再懸濁します。

細胞を培養プレートに移し、特定の成長因子を追加します。

成体の神経幹細胞は分裂し、神経球と呼ばれるクラスターを形成します。

細胞クラスター内の不適切な栄養分布は、細胞の成長を制限します。

クラスターを分散させるには、遠心分離して上清を廃棄します。クラスターを解離バッファーに再懸濁し、インキュベートします。

溶液を上下にピペットで移動して、単一細胞を生成します。

遠心分離して上清を廃棄します。

細胞を再懸濁し、適切な培地に移して単層を得る。

解剖

したら、マウスの脳を冷たいPBSバッファーに移し、2回すすぎ、余分な血液を除去します。次に、脳を氷上の脳マトリックスに置き、冠状に切り込みを入れて厚さ1ミリメートルのスライスを取得します。続いて、SCZ領域を含む後脳スライスを冷たいPBSに移します。

低倍率の解剖顕微鏡下で、曲げた30ゲージの針で皮質と海馬の白質領域からSCZを顕微解剖します。次に、SCZの上の皮質領域を除去し、解剖したSCZを氷上の35ミリメートルのペトリ皿内の冷たいPBSに入れます。

脳下ゾーンの領域は、脳マトリックスと曲げた30ゲージの針を使用して、組織全体から正確に解剖できます。

その後、PBSを取り除き、すぐに解剖した組織を細かく刻む。それらを1ミリリットルの消化バッファーで再懸濁します。その後、サンプルを2ミリリットルの消化バッファーを含む15ミリリットルのチューブに移します。次に、摂氏37度の水浴で30分間インキュベートします。

このステップでは、チューブを軽くたたいて消化された組織を解離させ、チューブを145倍gで5分間遠心分離します。5分後、上清を廃棄し、消化した組織を予熱した1ミリリットルと2つの培地で再懸濁して消化バッファーを洗い流し、サンプル溶液を最大5回静かにピペットで移動します。

次に、サンプルを再び145回gで5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞ペレットを1ミリリットルのN2培地に再懸濁します。1ミリリットルのN2培地をコーティングされていない6ウェルプレートに入れ、1ミリリットルの懸濁細胞を加えて、最終容量を2ミリリットルにします。

次に、20ナノグラム/ミリリットルのEGFと20ナノグラム/ミリリットルのbFGFを各ウェルに加えます。6ウェル培養皿を手で軽く振って、添加した成長因子をプレーティングした細胞と混合します。次に、6ウェルプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに保管します。

20ナノグラム/ミリリットルのEGFと20ナノグラム/ミリリットルのbFGFを毎日各ウェルに8日間加えます。3日ごとに、200マイクロリットルのN2培地を加えて、約2ミリリットルの培地を維持します。これは、8日後の神経球の画像です。

この手順では、神経球を集め、それらを新しい15ミリメートルの円錐形のチューブに移します。チューブを145倍gで5分間遠心分離します。続いて、上清を廃棄し、神経球を0.5ミリリットルの解離バッファーで再懸濁します。それらを摂氏37度のウォーターバスで0.5ミリリットルの解離バッファーと5分間インキュベートし、神経球を単一細胞に解離させます。

サンプル溶液を5回未満上下に静かにピペットで移動させ、チューブを145回gで5分間遠心分離します。続いて、上清を廃棄し、神経球を1ミリリットルのN2培地で再懸濁します。6ウェルプレートをPLLラミニンでコーティングした後、ウェルあたり2ミリリットルのN2培地で細胞を1ミリリットルあたり2.5 x 10⁵セルでプレートします。SCZ成体神経幹細胞を継代する前に、成長因子を毎日処理して5日間維持します。