歯髄細胞と三叉神経細胞の共培養を確立し、クロスコミュニケーションを実現

マウス歯髄組織から得られた間葉系幹細胞に富む懸濁液から始めます。

インキュベートして細胞の接着と増殖を可能にし、単層を形成します。

ラミニンでコーティングされた多孔質メンブレンインサートを歯髄細胞を含むウェルに入れます。

マウス脳由来の三叉神経細胞を含む共培養培地でインサートを播種します。ニューロンの付着を可能にするためにインキュベートします。

培地を、ウリジンや5-フルオロ-2デオキシウリジンなどの成長調節剤を含む共培養培地と交換します。

これらの分子は細胞に入り、DNA合成を阻害することで活発に増殖する間葉系幹細胞の増殖を制御します。

時間が経つにつれて、間葉系細胞は多孔質膜を通過して三叉神経細胞を刺激する小さなシグナル伝達分子を分泌します。

この刺激により、三叉神経細胞のニューロン突起が間葉系細胞に向かって伸びます。さらに、ニューロンはシグナル伝達分子を分泌し、相互コミュニケーションを可能にします。

マウスの安楽死後、口が天井に向けられ、首の付け根が作業面に平らになるように、使い捨てのアンダーパッドに頭を置きます。カミソリの刃をのこぎりで動かして、下顎骨を上顎骨から分離します。大臼歯にアクセスしやすくするために、はさみまたは鉗子で舌を取り除きます。

開いたヘッドを滅菌ガーゼパッドの上の皿に入れ、標本を解剖顕微鏡下に置きます。第一大臼歯を取り囲む歯槽骨組織を取り除きます。鉗子を歯槽開口部に挿入し、組織を歯から口の頬側または舌側に向かってからかいます。

すべての上顎第一大臼歯を収集し、顎下および上顎第一大臼歯を氷上の1X PBSを含む別の細胞培養皿にそっと移します。各上顎第一大臼歯の外側を囲むエナメル質の外臓を取り除きます。鉗子のセットを使用して、大臼歯を回転させて、尖頭が下がり、開いた歯根が露出するようにします。歯の底には楕円形の開口部があり、象牙質とエナメル質の薄い層でカプセル化された不透明な歯髄組織があります。

鉗子の先端を使用して、鉗子の片方の腕を石灰化組織の内周に回して歯髄をそっと緩めます。歯髄組織を石灰化構造から取り除き、1X PBSを含む3番目の皿に移します。エナメル質の外臓器がまだ分離されていない場合は、エナメル質の外臓器を取り除きます。

すべての歯髄組織を 50 ミリリットルの円錐形チューブで 0.25% トリプシン EDTA に移します。混合物をボルテックスし、摂氏37度の温水浴に10分間入れます。滅菌フードの下で、加温した共培養培地をトリプシンに対する培地と少なくとも1対1の最終比率まで加え、酵素を不活性化します。10ミリリットルのピペットで培地を上下に複数回ピペットで移動させ、歯髄を培地にさらに分散させます。大きな気泡は避けてください。

分散

した歯髄1ミリリットルを24ウェル組織培養プレートの各ウェルに移します。プレートを摂氏37度