シングルユースバイオリアクターを用いた人工多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドの作製

ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)をバイオリアクターにシードします。iPS細胞は、細胞性アポトーシス阻害剤を含む培地に再懸濁されます。

磁場下では、バイオリアクターの垂直ホイールが制御された速度で回転し、細胞間の接触と凝集体の形成を促進します。ほとんどの培地を取り除き、阻害剤を含まない新しい培地を追加します。

培養を続けてください。骨材が最適なサイズに達したら、重力によって沈殿させます。培地を取り除きます。

成長因子を含む分化培地を添加し、バイオリアクターのホイール速度を下げて培養します。成長因子は、凝集体内の神経分化を促進します。

次に、小脳前駆細胞の発達を誘導する成長因子とケモカインを添加した新鮮な培地を追加します。

徐々に、小脳前駆細胞は凝集体内の異なる層に組織化され、初期の小脳オルガノイドを形成します。

最後に、特定の神経栄養因子を含むニューロン培地を追加します。

これらの因子は、小脳前駆細胞をシナプス活性の機能的小脳ニューロンに成熟させ、成熟したオルガノイドを生成します。

1日目に、0日目をバイオリアクターの播種日として、バイオリアクターとベースユニットを滅菌フローフードに入れます。次に、血清学的ピペットを使用して、細胞懸濁液の1ミリリットルサンプルを収集します。細胞懸濁液を超低付着24ウェルプレートにプレートします。顕微鏡を使用して、iPS細胞由来の凝集体が形成されたことを確認します。その場合は、アグリゲートのイメージを 40 倍または 100 倍でキャプチャします。

凝集体の平均直径が100マイクロメートルになるまで、バイオリアクターでiPS細胞の培養を続けます。次に、培地の80%をROCK阻害剤を含まない新鮮なmTesR1に置き換えます。凝集体が直径200〜250マイクロメートルに達したら、すべてのオルガノイドをバイオリアクターの底に沈殿させます。次に、使用済み培地をすべてgfCDM分化培地に交換します。

ベースユニットとバイオリアクターをインキュベーターに入れ、撹拌を25 RPMに減らします。