マウスの脳からの腫瘍浸潤免疫細胞の単離

腫瘍を含む灌流マウスの脳を取ります。

灌流ステップでは、循環免疫細胞は除去されますが、腫瘍浸潤細胞は保持されます。

腫瘍を含む組織を分離します。

次に、組織を機械的に解離します。

機械的な力が組織を緩め、細胞を解放します。

解離した組織をチューブに移します。

片を含む上清を遠心分離して廃棄します。

コラゲナーゼとDNaseを含む消化液に組織を再懸濁します。

コラゲナーゼは細胞外マトリックスを分解し、細胞を放出します。DNaseは汚染DNAを分解します。

酵素活性を停止するためのバッファーを追加します。

懸濁液をろ過して細胞凝集体を除去し、単一細胞懸濁液を得る。

遠心分離して上清を廃棄します。

細胞を高密度グラジエント培地に再懸濁します。次に、低密度のグラジエント培地でオーバーレイし、明確な界面を持つ分離グラジエントを形成します。

心分離して層を分離します。免疫細胞は勾配培地間の界面に集まり、細胞破片はその上に浮かびます。

さらなる分析のために免疫細胞を収集します。

この手順では、きれいな片刃のカミソリの刃を使用して、脳の中心を矢状面で切り下げて2つの半球を二等分することにより、腫瘍を含む脳の領域を分離します。同側半球の内側を下にして、小脳で冠状の切り込みを1つ、嗅球の切り込みを1つ行い、腫瘍インプラントを含む標的組織を分離します。

次に、標的組織を、1ミリリットルのDPBSを含む標識されたガラスダウンティッシュグラインダーに入れます。プランジャーを最後まで押し下げ、7回ひねって組織を破壊します。その後、プランジャーを持ち上げて、液体がティッシュグラインダーの底に戻るようにします。この手順を 3 回繰り返します。ただし、脳組織の過度の摩擦を避けるために、次の2回の繰り返しの間にプランジャーを4回、最後の繰り返しの間に3回だけひねってください。

いて、1ミリリットルの氷冷DPBSをプランジャーの側面に3回塗布し、残存した脳物質をティッシュグラインダーにすすぎます。次に、粉砕した脳物質を上下にピペッティングして再懸濁し、氷上のラベル付き15ミリリットル遠心分離管に入れます。DAPSティッシュグラインダーの側面をさらに1ミリリットルの氷冷DPBSですすぎ、同じ15ミリリットルの遠心分離管に加えます。

すべてのサンプルが処理されるまで、粉砕された脳物質を含むすべてのチューブを氷の上に保管します。次に、粉砕した脳物質を15ミリリットルの遠心分離管内で摂氏4度で20分間740倍gで回転させます。次に、上清を除去し、ペレット状の脳物質を、事前に調製したコラゲナーゼとDNase I消化酵素の混合物1ミリリットルに再懸濁します。

15ミリリットルの遠心分離管を試験管ラックに入れ、ラックを摂氏37度の水浴に15分間置き、次に、チューブをフリックしてインキュベーション期間中にサンプルを2回穏やかに攪拌し、組織の分解を促進します。

いて、氷冷したDPBSを各チューブに6ミリリットル加えて、消化酵素を希釈します。ピペットを上下にピペットでかけて再懸濁し、滅菌済みの70ミクロンのナイロンメッシュフィルターを通して、氷上の新しい標識付き15ミリリットル遠心分離管に総量をろ過します。

その後、脳細胞懸濁液を摂氏4度で20分間740倍gで回転させ、単一細胞ペレットを実現します。15ミリリットルのチューブを遠心分離機から取り出し、氷の上に置きます。次に、次のステップに備えて、遠心分離機の温度設定を摂氏約 21 度に上げます。

次に、細胞上清を完全に除去し、最初にP1000マイクロピペットを使用して、細胞ペレットを1ミリリットルの70%密度遠心分離培地に再懸濁します。次に、各チューブに4ミリリットルの70%密度の遠心分離培地を追加します。キャップをしっかりと装着し、チューブを数回静かに反転させて細胞懸濁液を均質化します。

その後、70%密度の遠心分離培地に再懸濁した脳細胞を含む15ミリリットルの遠心分離管を氷から試験管に室温で戻します。一度に 1 つずつ、2 ミリリットルの 37% 密度の遠心分離培地溶液を 5 ミリリットルの 70% 密度の遠心分離培地に慎重に重ねて、2 つの密度の遠心分離培地層の間にきれいな界面を形成します。

次に、先端の細いマーカーで2つの層間の界面の位置をマークし、遠心分離後に区別が目立たなくなったときに簡単に識別できるようにします。15ミリリットルの遠心分離管を740倍gで室温で20分間、中断することなく回転させ、密度遠心分離培地層間の界面を破壊しないようにします。

その後、脂質層を慎重にバイパスして、P200マイクロピペットをチューブに導入することにより、2つの密度遠心分離培地層間の界面に蓄積したPBMCを収集します。PBMCバンドのレベルに達したら、70%密度の遠心分離培地層の表面から200マイクロリットルをゆっくりと抽出し、氷上のそれぞれ標識されたポリプロピレンFACSチューブに移します。このステップを1回繰り返すと、サンプルあたり400マイクロリットルの総容量が得られます。