マウスの脳からの腫瘍浸潤免疫細胞の単離

腫瘍を含む灌流マウスの脳を取ります。

灌流ステップでは、循環免疫細胞は除去されますが、腫瘍浸潤細胞は保持されます。

腫瘍を含む組織を分離します。

次に、組織を機械的に解離します。

機械的な力が組織を緩め、細胞を解放します。

解離した組織をチューブに移します。

破

片を含む上清を遠心分離して廃棄します。

コラゲナーゼとDNaseを含む消化液に組織を再懸濁します。

コラゲナーゼは細胞外マトリックスを分解し、細胞を放出します。DNaseは汚染DNAを分解します。

酵素活性を停止するためのバッファーを追加します。

懸濁液をろ過して細胞凝集体を除去し、単一細胞懸濁液を得る。

遠心分離して上清を廃棄します。

細胞を高密度グラジエント培地に再懸濁します。次に、低密度のグラジエント培地でオーバーレイし、明確な界面を持つ分離グラジエントを形成します。

遠

心分離して層を分離します。免疫細胞は勾配培地間の界面に集まり、細胞破片はその上に浮かびます。

さらなる分析のために免疫細胞を収集します。

この手順では、きれいな片刃のカミソリの刃を使用して、脳の中心を矢状面で切り下げて2つの半球を二等分することにより、腫瘍を含む脳の領域を分離します。同側半球の内側を下にして、小脳で冠状の切り込みを1つ、嗅球の切り込みを1つ行い、腫瘍インプラントを含む標的組織を分離します。

次に、標的組織を、1ミリリットルのDPBSを含む標識されたガラスダウンティッシュグラインダーに入れます。プランジャーを最後まで押し下げ、7回ひねって組織を破壊します。その後、プランジャーを持ち上げて、液体がティッシュグラインダーの底に戻るようにします。この手順を 3 回繰り返します。ただし、脳組織の過度の摩擦を避けるために、次の2回の繰り返しの間にプランジャーを4回、最後の繰り返しの間に3回だけひねってください。

続

いて、1ミリリットルの氷冷DPBSをプランジャーの側面に3回塗布し、残存した脳物質をティッシュグラインダーにすすぎます。次に、粉砕した脳物質を上下にピペッティングして再懸濁し、氷上のラベル付き15ミリリットル遠心分離管に入れます。DAPSティッシュグラインダーの側面をさらに1ミリリットルの氷冷DPBSですすぎ、同じ15ミリリットルの遠心分離管に加えます。

すべてのサンプルが処理されるまで、粉砕された脳物質を含むすべてのチューブを氷の上に保管します。次に、粉砕した脳物質を15ミリリットルの遠心分離管内で摂氏4度で20分間740倍gで回転させます。次に、上清を除去し、ペレット状の脳物質を、事前に調製したコラゲナーゼとDNase I消化酵素の混合物1ミリリットルに再懸濁します。

15ミリリットルの遠心分離管を試験管ラックに入れ、ラックを摂氏37度の水浴に15分間置き、次に、チューブをフリックしてインキュベーション期間中に