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ラットの脳由来のグリア細胞の接着培養を含むマイクロプレートを取ります。培養物には、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトが含まれています。
培地を取り出し、酵素溶液とインキュベートして細胞を剥離し、チューブに移します。
遠心分離し、細胞破片を含む上清を除去します。細胞を温かい培地に再懸濁します。
シリンジを使用して粉砕して細胞の塊を分解し、ストレーナーを使用してろ過して単一細胞懸濁液を取得します。
光架橋可能な生体高分子、架橋剤、細胞外マトリックス成分を添加します。
混合物をカバーガラスに取り付けられた型に注ぎます。混合物を高強度の光にさらして架橋を誘導し、ゲルを形成してグリア細胞をカプセル化します。
型を取り外し、カバーガラスをマイクロプレートに入れます。温かい培地を加え、生理学的条件下でゲルをインキュベートします。
細胞は支持する細胞外マトリックス内で増殖し、細胞ネットワークを形成し、グリア細胞の三次元培養を確立します。
細胞カプセル化の24時間前に、2週間の初代培養から培地を吸引し、各ウェルに1ミリリットルの新鮮な培地を加えます。細胞カプセル化の日に、12ウェルプレートごとに12.5ミリリットルの希釈トリプシンと25ミリリットルの培地を調製し、ウォーターバスで摂氏37度に温めます。次に、10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、約1ミリリットルの希釈トリプシンを12ウェルプレートの各ウェルに加えます。
コンフルエント細胞層がプレートから剥がれるまで、摂氏37度、二酸化炭素5%で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルのピペットを使用して、単一の浮遊片として現れる分離した細胞を回収し、15ミリリットルの円錐形遠心分離管に移します。等量の培地で希釈し、室温で2分間200倍gで遠心分離します。
遠心分離後、上清を廃棄し、細胞ペレットを10ミリリットルの温かい培地に再懸濁します。ピペットで細胞を5回粉砕し、次に、200回gで2分間再び遠心分離します。スピン後、上清をデカントし、細胞を5ミリリットルの温め培地に再懸濁し、細胞を50ミリリットルの円錐形遠心分離管に移します。
次に、18ゲージの針が付いた10ミリリットルのシリンジを使用して、細胞溶液を3回粉砕し、懸濁液を40ミクロンの細胞ふるいを通して新しい円錐形の遠心分離管にろ過します。次に、10マイクロリットルの細胞懸濁液を収集し、温かい培地で1〜100に希釈し、自動セルカウンターで細胞をカウントします。
残りの細胞を摂氏37度のウォーターバスでカプセル化ステップまでインキュベートします。3Dヒドロゲルの各植物12ウェルプレートに12.5ミリリットルのナイーブ培地と12.5ミリリットルのコンディショニング培地を温めます。次に、植物12ウェルプレートあたり7ミリグラムのHAMAを計量し、体積重量の2%の濃度でろ過した滅菌に添加します。HAMAが完全に溶解するまで、溶液を20キロヘルツで60分間超音波処理します。
超音波処理中に、TEAとNVPの両方の個々の10%溶液を調製します。また、滅菌PBSの1ミリリットルアリコートにエオシンの1ミリモル溶液を調製します。次に、各12ウェルプレートについて、1 x 107細胞、0.5%HAMA、PBS中の20%基底層混合物、0.1%TEA、0.1%NVP、および0.01ミリモルエオシンYの最終的な1.4 1.4ミリリットルの混合物を作成します。
溶液を穏やかに混合した後、1ミリリットルのチップが取り付けられたピペットを使用して、各PDMSモールドに100マイクロリットルを分注します。次に、サンプルを密閉された箱に入れた高輝度の緑色LEDライトに室温で5分間さらします。
5分間の緑色LED露光は、3Dゲルを形成するために不可欠です。エオシンYによって導入された赤色は透明になり、反応の終了を示します。
次に、12ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの温かく調整された培地を加えます。親指と人差し指で各カバーガラスをつかみ、湾曲したピンセットを使用して、ゲルをずらさずにPDMSモールドをゆっくりと剥がします。型を調整された媒体の入ったウェルに入れます。
金型の取り外しは最も困難なステップです。ゲルが外れたり、カバーガラスが破損したりしないように、細心の注意を払って行う必要があります。これには練習が必要かもしれません。
すべての型をプレートのウェルに移した後、各ウェルにさらに1ミリリットルの温かいDMEM / F12培地を追加します。イメージングする前に、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素とともに2週間インキュベートします。