非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞の神経前駆細胞への分化

細胞外マトリックス(ECM)でコーティングされたマルチウェルプレートを取ります。

別々のウェルに、非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞(hPSC)を培地に導入します。

トランスジェニックhPS細胞は抗生物質誘導性プロモーターの下で導入遺伝子を運ぶ導入遺伝子は、神経分化を誘導する転写因子をコードしています。

ECMへの細胞接着を促進するためにインキュベートします。培地中の小分子はアポトーシスを防ぎ、細胞増殖を促進します。

細胞を解離させるために剥離溶液を加えます。培地を添加して解離を止め、細胞増殖を可能にするために別のECMコーティングマイクロプレートに移します。

小分子を含む神経分化培地を非トランスジェニック細胞に導入し、誘導抗生物質をトランスジェニック細胞に導入します。

小分子は、非トランスジェニック細胞が神経前駆細胞またはNPCに分化するように誘導します。トランスジェニック細胞では、抗生物質による転写因子の発現により、NPCへの分化に必要な遺伝子が活性化されます。

下流のアプリケーションのために培養中のNPCを維持します。

非トランスジェニックニューロン前駆細胞およびニューロン、またはhNeuronの生成については、14日目のhPS細胞由来の神経前駆細胞を2ミリリットルの神経培地とウェルあたりY27632を含むECMコーティングされた6ウェルプレートに挿入します。

ドキシサイクリン誘導性iNeuronを使用する場合は、細胞が約35%コンフルエントになったときにドキシサイクリンを含む神経培地を追加して、分化を誘導し、遺伝子発現を活性化します。2日後、トランスジェニックおよび非トランスジェニック株にウェルあたり1日あたり2ミリリットルの神経培地を供給します。細胞が70%のコンフルエンシーで持ち上げられる準備ができるまで続けます。