DRGニューロンの単離とシュワン細胞前駆体との共培養によるシュワン細胞の生成

ニューロンとグリア細胞を含む後根神経節(DRG)が付着したラット胚の脊髄を取ります。

個々のDRGをコードから取り外し、チューブに移し、遠心分離して組織の破片を廃棄します。

酵素を添加してDRGニューロンとグリア細胞を解離させます。

セルを回転させ、破片を取り除きます。ニューロン維持培地を加え、粉砕して単一細胞懸濁液を生成します。

濁液を培養基質でコーティングされたマイクロプレートに移し、細胞の接着を促進します。

精製培地を導入し、インキュベートします。培地の阻害剤は、分裂していないニューロンが生き残っている間、分裂しているグリア細胞を排除します。

シュワン細胞様細胞(SCLC)を共培養培地に取ります。シュワン細胞の前駆体であるSCLCは、胚性末梢神経ニューロンと相互作用します。

濁液をDRGニューロンに導入し、インキュベートします。SCLCとDRGニューロンとの相互作用は、シュワン細胞への成熟

生成されたシュワン細胞は分析の準備が整います。

後根神経節を採取するには、最初の胚を腹臥位で解剖顕微鏡下で室温PBSを含む10センチメートルの培養皿に移し、脊髄の両側に沿って顕微解剖鉗子を挿入します。

鈍的解剖を使用して、鉗子を使用して首の開口部と尾の切り株に沿って脊髄を切除し、脊髄を周囲の軟部組織から分離します。脊髄、神経根、および付着した後根神経節だけが残るまで、解放された脊髄から残存する軟部組織を取り除きます。

個々の後根神経節を接続神経根から切り離します。次に、1ミリリットルのピペットチップを備えたピペットペンを使用して、最大100個の後根神経節をPBSの1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

遠心分離によって神経節を回収し、チューブあたり200マイクロリットルの組換え酵素細胞解離試薬にペレットを再懸濁します。摂氏37度で10分間後、200マイクロリットルのピペットチップを使用して後根神経節を再び遠心分離し、後根節後ニューロン維持培地でペレットを穏やかに粉砕します。

根神経節細胞を1平方センチメートルあたり5 x 10³細胞で、1ウェルあたり1.5ミリリットルの後根神経節ニューロン維持培地にポリ-D-リジンラミニンでコーティングされた6ウェルプレートに播種します。

摂氏37度および5%CO₂で培養した2日後、細胞を洗浄し、ニューロン細胞培養物を新鮮な後根神経節ニューロン精製培地のインキュベーターにさらに2日間戻します。

3〜4回の維持および精製サイクルの後、後根神経節細胞培養は、ニューロンマーカーTuj-1に対して陽性であり、グリア細胞マーカーS100ベータに対して陰性である必要があります。

シュワン細胞様細胞培養の7日目に、細胞をPBSですすぎ、続いてウェルあたり0.5ミリリットルの組換え酵素細胞解離試薬で摂氏37度で5分間解離します。細胞ペレットを共培養培地に再懸濁し、シュワン細胞様細胞を精製された後根神経節ニューロン培養物に1 x 10 3細胞/平方センチメートルで播種し、摂氏37度および5%CO₂で14日間共培養します。