ハイドロゲルマイクロカラム内にアストロサイトスキャフォールドを作製するためのIn Vitro法

定義された直径の中空チューブからなるマイクロカラムボートを含む培養皿を取ります。

ハイドロゲルで作られたマイクロカラムには、乾燥を防ぐために緩衝液が充填されています。

実体顕微鏡下で、緩衝液を取り除き、細胞外マトリックスの成分である氷冷コラーゲン溶液を加えます。

カラムの水和を維持するために、皿の内縁に沿って培地を導入します。コラーゲンが重合し、マイクロカラム内にコーティングを形成する生理学的条件下でインキュベートします。

マイクロカラム内にアストロサイトを加え、インキュベートしてアストロサイトのコラーゲンへの接着を促進します。

次に、皿に培地を入れ、生理学的条件下で維持します。

マイクロカラムの直径が狭いため、アストロサイトは長さに沿って伸びる突起を持つ双極形態を獲得します。

時間が経つにつれて、アストロサイトは自己組織化して、アストロサイト突起の密な束を含む三次元足場を形成します。

ヒドロゲルで包まれたアストロサイト足場は、下流のアッセイの準備ができています。

バイオセーフティキャビネット内で、ラットテールI型コラーゲンの1ミリリットルあたり1ミリグラムの溶液を共培養培地に調製し、氷の上に置きます。pHが7.2〜7.4の範囲で安定するまで、必要に応じて酸または塩基でECM溶液のpHを調整します。マイクロカラムボートを鉗子で35または60ミリリットルのペトリ皿に移します。ステレオスコープをガイダンスとして使用し、マイクロピペットの10マイクロリットルの先端を各マイクロカラムの一端に配置し、吸引してDPBSの内腔と気泡を空にします。

P10マイクロピペットにコラーゲン溶液を充填します。10マイクロリットルのチップを各マイクロカラムの一端に置き、内腔を満たすのに十分な溶液を供給し、マイクロカラムの両端にECMのリザーバーをピペットで移します。すべてのカラムが満たされたら、カラムが乾燥するのを防ぐために、ペトリ皿の周りのリング状に培地をピペットで共培養します。

マイクロカラムを含む皿を摂氏37度、二酸化炭素5%で少なくとも1時間インキュベートして、細胞を加える前にコラーゲンの重合を促進します。その後、P10マイクロピペットの先端をマイクロカラムの一端に置き、約5マイクロリットルの細胞溶液を内腔に移して充填します。すべてのマイクロカラムをボートに播種した後、摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートして、ECMへのアストロサイトの付着を促進します。

インキュベーション期間の後、播種したマイクロカラムを含む皿に、それぞれ35または60ミリメートルのペトリ皿用の3または6ミリリットルの共培養培地を慎重に満たします。メッキしたマイクロカラムを摂氏37度、二酸化炭素5%の培養に維持して、整列した星状細胞束の自己組織化を促進し、6〜10時間後に束ねられたケーブル状の構造を形成するはずです。