0 閲覧数 • 4:20 分 • July 8th, 2025
密なニューロンネットワークを持つヒト多能性幹細胞由来の分化ニューロンを含む大きな培養プレートから始めます。
これらのニューロンを穏やかなタンパク質分解酵素でインキュベートしてプレートから切り離し、シートとして持ち上げます。
インキュベーションを続けると、酵素は細胞接続を部分的に破壊し、ニューロンネットワークを緩めます。
酵素活性を止めるために培地を追加します。
切り離されたニューロンを繰り返しピペットで移動させ、互いに分離します。
細胞ストレーナーでニューロンをろ過して細胞の塊を取り除き、個々のニューロンを収集します。
遠心分離して上清を除去します。それらを成長培地に再懸濁します。
再プレーティングのために、これらのニューロンをポリマーと接着タンパク質でコーティングされたマルチウェルプレートにシードします。彼らの付着を可能にするためにインキュベートします。
ニューロンは、生存を維持するために培地からの栄養素を利用します。栄養レベルを維持するために培地を定期的に交換してください。
さらにインキュベートして、ニューロンの成熟とそれらの間の接続の形成を可能にします。
まず、分化したニューロンのプレートをPBSで優しくすすぐことから始めます。PBSをプレートの壁に沿って分散させ、細胞に直接分散させないように、細胞を破壊しないようにします。細胞に触れないように注意しながら、皿を傾けながら皿の端からPBSを吸引します。
10センチメートルのプレートあたり少なくとも1ミリリットルのタンパク質分解酵素を適用し、細胞をインキュベーターに40〜45分間戻します。インキュベーション中は、位相差顕微鏡でニューロンをチェックし、ニューラルネットワークがプレートから完全に剥離してバラバラになり始めるまでプロテアーゼ処理を続けます。ニューロンが剥離したら、プロテアーゼ1ミリリットルごとに5ミリリットルの新鮮なDMEM培地を加えて消化を停止します。
血清学的ピペットを使用して、細胞をプレートに対して5〜8回穏やかに粉砕し、圧力をかけすぎないように注意してください。細胞を100マイクロメートルのメッシュを通して50ミリリットルのコニカルチューブに一滴ずつ濾し、さらに5ミリリットルの新鮮なDMEM培地でストレーナーをすすぎます。
卓上遠心分離機を使用して、細胞を1,000 g で5分間回転させます。遠心分離後、コニカルチューブをバイオセーフティキャビネットに戻し、ほとんどの培地を吸引し、細胞を湿らせるために250マイクロリットルを残します。細胞を2ミリリットルの新鮮なDMEM培地に静かに再懸濁し、5ミリリットルの血清学的ピペットの端に通します。
最後に、チューブを2〜3回反転させます。血球計算盤とトリパンブルーを使用して生細胞をカウントし、新鮮なDMEMで細胞を目的の濃度に希釈します。特定の細胞株の要件に応じて適切なサプリメントをチューブに追加し、円錐形のチューブを2〜3回傾けて細胞を穏やかに混合します。
24ウェルプレートからラミニンコーティングを吸引し、PBSで一度すすいでください。PBSを吸引し、凝集を避けるために細胞溶液を8の字の動きで各ウェルに適用します。細胞のプレーティングが終了したら、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%に設定されたインキュベーターに戻します。
本記事では、ヒト多能性幹細胞由来の分化神経細胞を剥離し、再播種するためのプロトコルを詳細に説明します。この手法では、タンパク質分解酵素を用いて、今後の実験に供するための生存能を維持しながら神経細胞を分離します。
ヒト多能性幹細胞由来の分化したニューロンを再播種することで、ニューロンの成熟度およびコネクティビティに関するスケーラブルでハイコンテンツなスクリーニングが可能になります。このワークフローは、ニューロンのフェノタイプを解析するための堅牢で再現性のあるシステムを提供し、初期段階の発見およびターゲットバリデーションを支援します。本手法は、ダウンストリームアッセイに向けたニューロン調製を標準化することで、神経生物学に特化したポートフォリオにおける予測精度を向上させます。
本手法は、フェノタイプスクリーニングおよびメカニズム解析に向けたヒトニューロンの標準化された調製を可能にすることで、創薬探索から前臨床に至る連続的なプロセスへと統合されます。
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最終更新:22 8月 2026