マイクロ流体チップを用いたヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドの開発

ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)を、Rhoキナーゼ阻害剤を含む栄養豊富な幹細胞培地に投与します。

阻害剤は細胞に入り、Rhoキナーゼ酵素をブロックし、アポトーシス細胞死を防ぎます。

細胞は栄養素を利用して増殖し、自発的に凝集してスフェロイドと呼ばれる立体的な細胞クラスターを形成します。

徐々に、培地を神経誘導培地に置き換えます。培地からのシグナル伝達モジュレーターは、幹細胞から神経細胞への分化を促進します。

成長因子が豊富な神経培地に置き換えて、スフェロイド細胞を運動ニューロンに分化させ、運動ニューロンスフェロイドまたはMNSを形成します。

これらのMNSを、成熟培地を含むポリマーコーティングされたマイクロ流体チップに移します。

培地中の神経成長因子は、軸索またはニューロンのより長い突起を刺激して、スフェロイドから成長し、チップのマイクロチャネルを通って伸びます。

これにより、運動神経組織の3次元モデルである運動神経オルガノイドが形成されます。

3D iPS細胞を運動ニューロンに分化させるには、10マイクロモルのY27632を添加した100マイクロリットルのフィーダーおよび無血清細胞培地に、ウェルあたり4×10⁴個のiPS細胞を96ウェルU底プレートの適切なウェル数に播種します。

翌日、各ウェルの上清を、10マイクロモルのSB-431542および100ナノモルのLDN-193189を添加した100マイクロリットルのKSR培地に置き換えます。2日目と3日目に、上清を10マイクロモルのSB-431542、100ナノモルのLDN-193189、5マイクロモルのDAPT、5マイクロモルのSU-5402、1マイクロモルのレチノイン酸、および1マイクロモルの平滑化アゴニストを添加した100マイクロリットルのKSR培地に置き換えます。4日目と5日目に、上清を75%のKSR培地と25%のN2培地の混合物に置き換え、10マイクロモルのSP-431542、100ナノモルのLDN-193189、5マイクロモルのDAPT、5マイクロモルのSU-5402、1マイクロモルのレチノイン酸、および1マイクロモルの平滑化アゴニストを添加します。

6日目と7日目に、上清を50%のKSR培地と50%のN2培地の混合物に置き換え、5マイクロモルDAPT、5マイクロモルのSU-5402、1マイクロモルのレチノイン酸、および1マイクロモルの平滑化アゴニストを添加します。8日目と9日目に、上清を25%のKSR培地と75%のN2培地の混合物に置き換え、5マイクロモルDAPT、5マイクロモルのSU-5402、1マイクロモルのレチノイン酸、および1マイクロモルの平滑化アゴニストを添加します。10日目と11日目に、上清を5マイクロモルDAPT、5マイクロモルSU-5402、1マイクロモルレチノイン酸、および1マイクロモル平滑化アゴニストを添加したN2培地に置き換えます。12日目に、各ウェルの上清を100マイクロリットルの成熟培地に置き換え、ウェルあたり1ミリリットルあたり20ナノグラムの脳由来神経栄養因子を補充します。

運動神経オルガノイド形成を誘導するには、PDMSチップ内のコーティング溶液を、1ミリリットルあたり20ナノグラムの脳由来神経栄養因子を添加した150マイクロリットルの成熟培地に置き換え、ワイドボアマイクロピペットチップを使用して、96ウェルプレートの1つのウェルからチップのマイクロチャネルの入口に運動ニューロンスフェロイドを穏やかに添加します。培地の蒸発を防ぐために、皿内の組織培養チップの近くに滅菌水の小さなリザーバーを置き、皿を摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに入れます。

2〜3日ごとに、培地リザーバーの中心から使い果たされた培地の半分を、1ミリリットルあたり20ナノグラムの脳由来神経栄養因子を添加した新鮮な成熟培地に交換します。軸索は運動ニューロンスフェロイドからチャネルに成長し、2〜3週間かけて自発的に単一の束に組み立てられ、運動神経オルガノイドを形成します。