マイクロ流体チップを用いたヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドの開発

ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)を、Rhoキナーゼ阻害剤を含む栄養豊富な幹細胞培地に投与します。

阻害剤は細胞に入り、Rhoキナーゼ酵素をブロックし、アポトーシス細胞死を防ぎます。

細胞は栄養素を利用して増殖し、自発的に凝集してスフェロイドと呼ばれる立体的な細胞クラスターを形成します。

徐々に、培地を神経誘導培地に置き換えます。培地からのシグナル伝達モジュレーターは、幹細胞から神経細胞への分化を促進します。

成長因子が豊富な神経培地に置き換えて、スフェロイド細胞を運動ニューロンに分化させ、運動ニューロンスフェロイドまたはMNSを形成します。

これらのMNSを、成熟培地を含むポリマーコーティングされたマイクロ流体チップに移します。

培地中の神経成長因子は、軸索またはニューロンのより長い突起を刺激して、スフェロイドから成長し、チップのマイクロチャネルを通って伸びます。

これにより、運動神経組織の3次元モデルである運動神経オルガノイドが形成されます。

3D iPS細胞を運動ニューロンに分化させるには、10マイクロモルのY27632を添加した100マイクロリットルのフィーダーおよび無血清細胞培地に、ウェルあたり4×10⁴個のiPS細胞を96ウェルU底プレートの適切なウェル数に播種します。

翌日、各ウェルの上清を、10マイクロモルのSB-431542および100ナノモルのLDN-193189を添加した100マイクロリットルのKSR培地に置き換えます。2日目と3日目に、上清を10マイクロモルのSB-431542、100ナノモルのLDN-193189、5マイクロモルのDAPT、5マイクロモルのSU-5402、1マイクロモルのレチノイン酸、および1マイクロモルの平滑化アゴニストを添加した100マイクロリットルのKSR培地に置き換えます。4日目と5日目に、上清を75%のKSR培地と25%のN2培地の混合物に置き換え、10マイクロモルのSP-431542、100ナノモルのLDN-193189、5マイクロモルのDAPT、5マイクロモルのSU-5402、1マイクロモルのレチノイン酸、および1マイクロモルの平滑化アゴニストを添加します。

6日目と7日目に、上清を50%のKSR培地と50%のN2培地の混合物に置き換え、5マイクロモルDAPT、5マイクロモルのSU-5402、1マイクロモルのレチノイン酸、および1マイクロモルの平滑化アゴニストを添加します。8日目と9日目に、上清を25%のKSR培地と75%のN2培地の混合物に置き換え、5マイクロモルDAPT、5マイクロモルのSU-5402、1マイクロモルのレチノイン酸、および1マイクロモルの平滑化アゴニストを添加します。10日目と11日目に、上清を5マイクロモルDAPT、5マイクロモルSU-5402、1マイクロモルレチノイン酸、および1マ