ハンギングドロップ法によるマウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞の生成

0 閲覧数3:09 • July 8th, 2025

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マウス胚性幹細胞懸濁液を取ります。

遠心分離し、上清を除去し、細胞を神経分化培地に再懸

濁します。

懸濁液の液滴を培養プレートの蓋の内側に置きます。

液滴の乾燥を防ぐために、底板に緩衝液を追加します。底板に蓋を置き、吊り下げ滴培養を形成し、インキュベートします。

重力により、細胞はクラスター化され、胚様体またはEBと呼ばれる3次元凝集体を形成します。

液滴を分化培地を含むプレートに入れ、EBの増殖のために攪拌下でインキュベートします。

遠心分離して培地を取り除きます。レチノイン酸を添加した分化培地にEBを再懸濁し、培養プレートに移し、インキュベートします。

レチノイン酸が細胞に入り、転写複合体の形成を引き起こします。この複合体は遺伝子発現を誘導し、神経前駆細胞への分化を引き起こします。

差別化されたEBは、下流のアプリケーションに対応しています。

まず、ハンギングドロップセル培養をセットアップします。10センチメートルの細胞培養プレートの場合、分化培地20マイクロリットルあたり500細胞に濃度を調整します。50個の20マイクロリットルの液滴に十分な細胞懸濁液を調製します。マイクロピペットまたはリピーターピペットを使用して、20マイクロリットルの細胞懸濁液の液滴を組織培養プレートの蓋に置き、液滴が融合しないように近づきすぎないようにします。

プレートに5〜10ミリリットルのPBSを入れ、慎重に蓋をプレートに戻します。摂氏37度のインキュベーターで培養物をインキュベートします。2日後、蓋から液滴を集め、10ミリリットルの分化培地で満たされた10センチメートルの細胞培養懸濁プレートに入れます。次に、インキュベーター内で低速に設定されたオービタルシェーカーにプレートを置きます。さらに2日後、細胞を200倍gで3分間遠心分離し、上清を除去します。

様体の神経前駆細胞への分化を誘導するには、細胞を5マイクロモルレチノイン酸を含む分化培地に再懸濁します。プレートを2日間インキュベートします。次に、プレートを傾けてピペットで取り出すことで、培地の少なくとも半分を新鮮な培地に交換します。

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最終更新:15 8月 2026